Imegen

Identificación de las fusiones de ALK, ROS1 y RET mediante un ensayo multiplexado basado en ARNm en muestras de tejido parafinado de pacientes con cáncer de pulmón de célula no pequeña avanzado

 

Cristina Teixidó1, Aleix Prat2,3, Miguel Ángel Molina-Vila1 y Noemí Reguart2,3

 

1 Pangaea Oncology, Laboratorio de Oncología, Hospital Universitario Quirón Dexeus, Barcelona, España

2 Oncología Médica, Hospital Clínic, Barcelona, España

3 Genómica traslacional y terapias dirigidas en tumores sólidos, Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS), Barcelona, España

 

 

Células de cáncer de pulmón no microcítico. Imagen: Ed Uthman (CC BY 2.0 https://creativecommons.org/licenses/by/2.0/).

Células de cáncer de pulmón no microcítico. Imagen: Ed Uthman (CC BY 2.0 https://creativecommons.org/licenses/by/2.0/).

El cáncer de pulmón continúa siendo la primera causa de muerte por cáncer en el mundo. La mayoría de los pacientes con cáncer de pulmón de célula no pequeña (CPCNP) debutan con  enfermedad avanzada y tienen un pronóstico extremadamente pobre. Aunque durante años el abordaje de esta enfermedad se ha basado en el tratamiento  sistémico con quimioterapia, la caracterización completa del genoma tumoral ha permitido identificar drivers oncogénicos que han facilitado el desarrollo de terapias dirigidas con resultados muy superiores al los del tratamiento habitual con quimioterapia.  En torno al 5% -7% de los pacientes con CPCNP tienen tumores que dependen de oncogenes de fusión que implican a anaplastic lymphoma kinase (ALK), ROS proto-oncogene 1 (ROS1) y RET proto-oncogene (RET) (Soda et al., 2007; Takeuchi et al., 2012) y son sensibles a fármacos dirigidos. La detección de estos genes de fusión, generalmente identificada por las técnicas estándar de hibridación in situ fluorescente (FISH) o inmunohistoquímica (IHQ), es muy importante para guiar las decisiones de tratamiento específico.

En la práctica clínica, las muestras de tejido parafinadas (FFPE) de CPCNP avanzado se utilizan para la detección de las tres alteraciones genéticas más comunes en esta patología: las mutaciones en el gen epidermal growth factor receptor (EGFR), mutaciones en KRAS proto-oncogene, GTPase (KRAS) y reordenamientos de ALK, mientras que la de otros oncogenes de relevancia como ROS1 y RET se analizan más excepcionalmente. Una de las principales limitaciones en el proceso de caracterización genética del CPCNP es la escasez de tejido obtenido de las biopsias pulmonares, por lo que la evaluación multiplex en lugar de una secuencial de cada uno de los oncogenes permitiría la optimización del material. Además, los test habituales de FISH e IHQ  están sujetos a un mayor grado de subjetividad por parte del evaluador.

La plataforma nCounter permite realizar test multiplexados de transcritos de fusión (ARNm) mediante perfiles digitales directos o tecnología counting. Esta tecnología utiliza sondas de 50 nucleotidos y, en contraste con las nuevas plataformas de secuenciación (next generation sequencing, NGS), se basa en la hibridación directa sin síntesis de ADN complementario o amplificación por PCR. En este estudio hemos validado esta plataforma en el entorno clínico, demostrando que permite la detección eficaz de los genes de fusión ALK, ROS1 y RET a partir de muestras de tejido parafinado e identifica un mayor número de casos positivos que podrían beneficiarse de las terapias dirigidas (Reguart et al., 2017). Para ello, nuestro grupo analizó, mediante tecnología nCounter, el ARN extraído de muestras FFPE de una cohorte retrospectiva de 108 pacientes con CPCNP avanzado. Los resultados se compararon con los obtenidos mediante técnicas habituales (FISH e IHQ) y se recogió información clínica de un subgrupo de pacientes. La cohorte analizada estaba enriquecida con pacientes positivos para ALK y ROS1 detectados por FISH o IHQ, así como con muestras EGFR-KRAS wild type (WT).

Nuestro trabajo (Reguart et al., 2017) demuestra que la plataforma nCounter necesita una cantidad reducida de material genético para conseguir un análisis óptimo. En concreto, para laminillas de FFPE basta un grosor de 4 mm con un área tumoral de de 1.1 mm2 y un 10% de contenido tumoral para obtener resultados satisfactorios. Respecto a la cantidad de  ARN,  con 25-200 nanogramos son suficientes.

En el conjunto final de muestras evaluables por nCounter (n=98), se identificaron un total de 55 con transcriptos de fusión: 32 para ALK, 21 para ROS1 y dos para RET. La positividad para ALK, ROS1 y RET en nuestra población de pacientes fue mutuamente excluyente con otros drivers oncogénicos. nCounter mostró una excelente concordancia con la IHQ de ALK (98.5%, CI 91.8 -99.7, Cohen k 0.97) y una concordancia sustancial con el FISH de ALK (87.5%, CI 79.0 -92.9, Cohen k 0.71). Cabe destacar que, en nuestro estudio, nCounter permitió identificar 10 casos positivos para genes de fusión que fueron calificados como negativos por FISH.  A este respecto, existe evidencia que las nuevas plataformas moleculares con técnicas NGS son más sensibles que el FISH en la detección de reordenamientos de ALK  (Ali et al., 2016).

En el caso de las fusiones de ROS1, se obtuvo un 86% (CI = 76.5-91.9, Cohen k 0.63) y un 87% (CI = 78.0-92.9, Cohen k 0.7) de concordancia entre nCounter vs. IHQ y FISH respectivamente, con un número significativo de muestras positivas sólo para una o dos técnicas. En nuestro estudio, de 21 pacientes ROS1 positivos por nCounter, dos (10%) fueron negativos por FISH y siete (33%) por IHQ. Tomados en conjunto, a diferencia de ALK, nuestros resultados no apoyan el uso de IHQ como la técnica estándar para determinar las fusiones de ROS1.

La evaluación de múltiples oncogenes de forma simultánea, en lugar de secuencial permitiría la optimización del material obtenido en biopsias pulmonares. Imagen: MedigenePress S.L.

La evaluación de múltiples oncogenes de forma simultánea, en lugar de secuencial permitiría la optimización del material obtenido en biopsias pulmonares. Imagen: MedigenePress S.L.

En nuestro trabajo pudimos recopilar información retrospectiva de la respuesta clínica a terapia dirigida en 29 pacientes. De los 25 pacientes que obtuvieron beneficio clínico (respuesta parcial o enfermedad estable durante más de 6 meses), 24 eran positivos por nCounter mientras que sólo 22 por FISH. Todos los pacientes que se beneficiaron del tratamiento dirigido con un inhibidor de ALK (n=18) eran nCounter positivos, mientras que tres resultaron negativos o no evaluables por la técnica estándar de FISH. De uno de los pacientes FISH negativo y nCounter-positivo se disponía de un seguimiento clínico completo, el paciente tuvo una buena respuesta a crizotinib durante más de tres años. Estos resultados, junto con los casos recientes publicados de pacientes con CPCNP ALK-FISH negativos/IHQ positivos con respuesta a inhibidores de ALK (Marchetti et al., 2016, Rosoux et al., 2016) cuestionan el FISH como técnica de elección e ilustran la importancia clínica de identificar la expresión del gen de ALK en lugar de la alteración cromosómica, que es una de las ventajas de la tecnología nCounter basada en transcritos.

Asimismo, se disponía de datos de respuesta de nueve pacientes identificados como ROS1 positivos y tratados con crizotinib. Los siete pacientes que obtuvieron beneficio clínico eran FISH positivos y seis también eran positivos por nCounter. El reexamen de la muestra restante reveló una infiltración tumoral muy baja (5%). Los dos pacientes que no obtuvieron beneficio clínico a crizotinib eran positivos por FISH, mientras que uno de ellos era negativo por nCounter.

Nuestros resultados demuestran que nCounter puede resultar más útil que otras tecnologías de NGS en pacientes con CPCNP avanzado ya que, a diferencia de éstas, permite el análisis de múltiples drivers moleculares, a partir de muestras  pequeñas de tejido parafinado y con requerimientos mínimos de material genético. En resumen, nuestro trabajo allana el camino para la implementación de la tecnología nCounter a nivel asistencial para el cribado de genes de fusión de ALK, ROS1 y RET.

Artículo de investigación:

Reguart N, et al. Identification of ALK, ROS1 and RET Fusions by a Multiplexed mRNA-Based Assay in Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Samples from Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer Patients. Clin Chem. 2017 Jan 10. pii: clinchem.2016.265314. doi: 10.1373/clinchem.2016.265314.

Bibliografía:

Ali SM, et al. Comprehensive Genomic Profiling Identifies a Subset of Crizotinib-Responsive ALK-Rearranged Non-Small Cell Lung Cancer Not Detected by Fluorescence In Situ Hybridization. Oncologist. 2016 Jun;21(6):762-70. doi: 10.1634/theoncologist.2015-0497

Marchetti A, et al. ALK Protein Analysis by IHC Staining after Recent Regulatory Changes: A Comparison of Two Widely Used Approaches, Revision of the Literature, and a New Testing Algorithm. J Thorac Oncol. 2016 Apr;11(4):487-95. doi: 10.1016/j.jtho.2015.12.111.

Rosoux A, et al. Effectiveness of crizotinib in a patient with ALK IHC-positive/FISH-negative metastatic lung adenocarcinoma. Lung Cancer. 2016 Aug;98:118-21. doi: 10.1016/j.lungcan.2016.06.001.

Soda M, et al. Identification of the transforming EML4-ALK fusion gene in non-small-cell lung cancer. Nature. 2007 Aug 2;448(7153):561-6. doi:10.1038/nature05945

Takeuchi K, et al. RET, ROS1 and ALK fusions in lung cancer. Nat Med. 2012 Feb 12;18(3):378-81. doi: 10.1038/nm.2658.

 

 

Si te ha gustado el artículo, suscríbete ahora de forma gratuita a la Revista Genética Médica y recíbela cada 2 semanas.


Acepto el Aviso Legal

You may also like...

Deja un comentario

Tu dirección de correo electrónico no será publicada. Los campos obligatorios están marcados con *

Normas de uso

La Revista Genética Médica permite realizar comentarios sobre su contenido para favorecer la participación de los lectores, con el objetivo de ofrecer una plataforma de debate y discusión sobre los temas tratados.

El contenido de Genética Médica es de carácter general y tiene una finalidad informativa. La mención de cualquier método, terapia, tratamiento o servicio no debe ser considerado una garantía para su utilización. Determinar el adecuado tratamiento para un paciente es responsabilidad de los médicos y facultativos. La información proporcionada en Revista Genética Médica ha sido diseñada para apoyar, y en ningún caso reemplazar, la relación que existe entre un paciente y su médico.

Para asegurar que todos los lectores tienen una buena experiencia, la Revista Genética Médica solicita que los comentarios sigan unas normas básicas. Los comentarios son evaluados antes de su publicación y moderados por los miembros de la Oficina Editorial de Revista Genética Médica diariamente. Cualquier comentario que no cumpla los principios indicados no será publicado.

Los comentarios están abiertos al público general por lo que los lectores deben considerar que su contenido no necesariamente ha sido realizado por un profesional médico.

Los usuarios tendrán en cuenta que los comentarios serán públicos y cualquier persona con acceso a internet podrá verlos. Los usuarios pueden publicar información personal propia (teniendo en cuenta que será pública) pero no la de otras personas. Los comentarios no podrán ser modificados.

Los principios seguidos para la publicación de comentarios serán:

  • Todos los comentarios que contribuyan a enriquecer el contenido y calidad de los contenidos de Revista Genética Médica serán bienvenidos. Los usuarios se comprometen a proporcionar información veraz y contrastable. Cada usuario proporcionará referencias y/o enlaces que justifiquen sus afirmaciones sobre medicina y salud, siempre que no se trate de una experiencia personal vivida por él mismo.
  • En caso de mencionar publicaciones científicas o datos específicos, se citarán las fuentes que en el comentario.
  • Sólo se aceptará la presencia de enlaces en los comentarios cuando su contenido cumpla los principios de publicación de comentarios y estén relacionados con el tema.
  • En caso de mencionar publicaciones científicas o datos específicos, se citarán las fuentes que en el comentario.
  • Sólo se aceptará la presencia de enlaces en los comentarios cuando su contenido cumpla los principios de publicación de comentarios y estén relacionados con el tema.
  • No se aceptarán comentarios difamatorios o falsos, insultos, amenazas, o ajenos al tema del que trate el artículo. En la misma línea no se aprobará la publicación de comentarios con contenido xenófobo, racista, sexista, homófobo o discriminatorio hacia cualquier religión o colectivo.
  • Los mensajes escritos al completo en mayúsculas no serán aceptados.
  • Mensajes publicitarios, o de cuestiones no relacionadas con el tema del artículo no serán aprobados para su publicación.

Si te ha gustado el artículo, suscríbete ahora de forma gratuita a la Revista Genética Médica y recíbela cada 2 semanas.

(function() { if (!window.mc4wp) { window.mc4wp = { listeners: [], forms : { on: function (event, callback) { window.mc4wp.listeners.push({ event : event, callback: callback }); } } } } })();


Acepto el Aviso Legal