Heterogeneidad génica en casos familiares de HSCR mediante combinación de WES y nuevas aproximaciones bioinformáticas

Macarena Ruiz-Ferrer, Berta Luzón-Toro y Salud Borrego

 Departamento de Genética, Reproducción y Medicina fetal, Instituto de Biomedicina de Sevilla, Hospital Universitario Virgen del Rocío/CSIC/Universidad de Sevilla, Sevilla, España.

Centro de Investigaciones Biomédicas en Red de Enfermedades Raras (CIBERER), Sevilla, España.

 

La enfermedad de Hirschsprung (HSCR, OMIM: 142623), o megacolon agangliónico, es una patología congénita que se caracteriza por la ausencia de los ganglios intramurales de los plexos entéricos en una porción variable del intestino grueso, como consecuencia de un fallo en la migración, proliferación, diferenciación y/o supervivencia de las células de la cresta neural durante el desarrollo del sistema nervioso entérico (SNE). Normalmente, esta patología aparece de forma esporádica, aunque también pueden encontrarse casos familiares en los que se observan patrones de herencia autosómicos dominantes y recesivos, con penetrancia y expresión variables. Al menos 25 genes han sido identificados hasta la fecha asociados a HSCR, siendo el proto-oncogén RET el principal gen de susceptibilidad. Actualmente, las nuevas técnicas de secuenciación de nueva generación (NGS) se plantean como una herramienta de gran ayuda para esclarecer la complejidad genética de HSCR. Pero desenmascarar las variantes génicas responsables de la enfermedad supone un desafío que requiere de aproximaciones bioinformáticas innovadoras que den sentido a los datos obtenidos mediante NGS. Por ello, la combinación de secuenciación de exoma completo (WES) junto con el análisis de interacciones proteína-proteína y rutas de señalización, podría ayudar a priorizar genes candidatos con relación funcional y constituiría una aproximación integrada y completa para estudiar esta enfermedad en la era postgenómica.

Hemos llevado a cabo el primer análisis mediante WES en un total 8 familias españolas que comprendían 16 pacientes HSCR (2 pacientes de cada una de ellas) y 32 familiares sanos. En primer lugar y como control de la técnica empleada, fueron confirmadas 5 mutaciones que habían sido previamente identificadas en el rastreo mutacional realizado mediante secuenciación Sanger de genes asociados a HSCR, pero que no podían explicar claramente la aparición del fenotipo en los individuos afectos. A continuación, tras distintos pasos de filtrado se detectaron una media de 160 variantes raras posiblemente patogénicas en cada paciente. La priorización de estas variantes se realizó en función de si eran compartidas entre las distintas familias y/o si se encontraban en genes que estaban relacionados con alguno de los genes previamente asociados a HSCR, mediante análisis de interacciones proteína-proteína y rutas de señalización. Finalmente, se seleccionaron un total de 246 variantes potencialmente implicadas en la enfermedad, validándose el 89,8% de estas mediante secuenciación Sanger.

Árboles genealógicos de las ocho familias incluidas en el estudio. Se representan con diferentes colores los genes identificados que pueden explicar el fenotipo en cada familia y sus correspondientes variantes. Luzón-Toro B, et al. Exome sequencing reveals a high genetic heterogeneity on familial Hirschsprung disease. Sci Rep. 2015 Nov 12;5:16473. doi: 10.1038/srep16473.

Árboles genealógicos de las ocho familias incluidas en el estudio. Se representan con diferentes colores los genes identificados que pueden explicar el fenotipo en cada familia y sus correspondientes variantes. Luzón-Toro B, et al. Exome sequencing reveals a high genetic heterogeneity on familial Hirschsprung disease. Sci Rep. 2015 Nov 12;5:16473. doi: 10.1038/srep16473.

Para cada familia, se analizó la segregación de estas variantes con el fenotipo según cada árbol familiar y sólo se observó segregación completa de distintas variantes en 3 de ellas. Según esto, los individuos afectos de la familia 8 portaban 2 variantes en heterocigosis compuesta en el gen AHNAK, cuya expresión había sido descrita inicialmente en tumores derivados de la cresta neural y posteriormente en células migratorias de la cresta neural. Ambas variantes eran heredadas de cada uno de los progenitores no afectos siguiendo un modo de herencia recesivo, que podría contribuir a explicar el fenotipo en esta familia, y además ambos pacientes también portaban una variante en ENDRB. En este contexto, la variante en ENDRB podría modular la penetrancia de las variantes en AHNAK o bien modificar la expresión de la enfermedad en los individuos afectos. Por otra parte, de los genes que se ajustaban a un modelo de herencia dominante en las familias 1 y 5 se priorizaron DYPD y CNTN5, respectivamente, debido al papel descrito para ambos genes en neurodesarrollo. Así, estudios anteriores basados en análisis de microarrays asociaron el gen DPYD a desarrollo neural al verse expresión en células progenitoras embrionarias. Por otra parte, CNTN5 se había visto implicado en las interacciones célula-célula que tienen lugar durante el desarrollo del sistema nervioso y el crecimiento de neuritas.

Además, se examinó si aparecía algún gen común en todas las familias que contribuyese a la aparición de la enfermedad mediante análisis de asociación de variantes raras en genes que estuviesen mutados en al menos dos familias. FAT3 fue el único gen que mostró una asociación significativa con el fenotipo HSCR, encontrándose 6 variantes diferentes precisamente en las 5 familias en las que no se encontraron variantes que co-segregasen con el fenotipo. FAT3 se expresa en células madre embrionarias y cabe enfatizar su papel en la morfogénesis celular durante la diferenciación celular. Por tanto, mutaciones en este gen podrían llevar a un desarrollo aberrante de las células pluripotentes derivadas de la cresta neural. Sin embargo, estas variantes no las compartían necesariamente los individuos afectos de una misma familia, por lo que mediante análisis de interacción proteína-proteína y rutas biológicas se examinó la existencia de variantes en otros genes que pudiesen explicar la segregación incompleta de las variantes de FAT3. De esta forma aparecieron también variantes en genes previamente asociados a HSCR, lo que reforzaba la validez del método. Tal es el caso de la familia 7, donde cambios en los genes FAT3, SEMA3D y PTCH1 parecen ser necesarios para explicar la aparición del fenotipo en los pacientes afectos, observándose un claro patrón de herencia poligénica. Con respecto a la familia 4, también aparecía alterado GFRA1 junto con los genes ZHX2, regulador del mantenimiento de progenitores neurales, y TPCN1, funcionalmente relacionada con PTCH1. En la familia 3 encontramos cambios en los genes IRAK3 y KDR, además de NTF3 y SEMA3D. KDR se ha visto recientemente asociado con supervivencia neuronal y esta función podría relacionarlo con la etiopatogenesis de HSCR. IRAK3 se ha relacionado con enterocolitis necrotizante, que se ha descrito en subgrupos específicos de pacientes HSCR y determina secuelas graves a largo plazo, siendo una de las mayores complicaciones de la enfermedad. Otro gen interesante fue CREBBP, identificado en la familia 6 y que parece esencial para la diferenciación de neuronas y glía durante el desarrollo del tubo neural. Se encontró una variante en este gen junto con una variante en TSC2, que podría estar relacionada con la alteración de la diferenciación y maduración de los precursores neurales, ya que la proteína para la que codifica regula tanto la proliferación como la migración celular, procesos cruciales en la enfermedad de HSCR. También se observó que variantes en los genes relacionados PLAU y FBN1 coexistían con las de FAT3 en los pacientes de la familia 2. En resumen, la contribución de diferentes combinaciones de variantes en genes previamente conocidos como asociados a HSCR y otros genes candidatos para el desarrollo del SNE, junto con variantes en FAT3 podrían llevar a la expresión del fenotipo HSCR en cada uno de los pacientes de estas familias.

Los resultados proporcionados por nuestro estudio muestran un notable grado de heterogeneidad génica tanto inter- como intrafamiliar. Uno de los criterios necesarios para la priorizaron de genes fue la aparición de variantes compartidas por los individuos afectos de una misma familia y, sin embargo, esto no fue siempre posible debido a la heterogeneidad encontrada dentro de cada familia. Por tanto, ha sido necesario encontrar variantes en genes diferentes para poder explicar las diferencias entre pacientes de una misma familia. Además, nuestros hallazgos muestran de nuevo que los genes asociados a HSCR suelen presentar mutaciones con penetrancia incompleta y variaciones interfamiliares. En conclusión, nuestros resultados han llevado a la identificación de varios genes nuevos que podrían jugar un papel en la aparición de HSCR o el desarrollo del sistema nervioso entérico, aunque la complejidad de los casos familiares de HSCR revelada por este estudio resalta las dificultades actuales para el consejo genético en esta enfermedad.

Referencia: Luzón-Toro B, et al. Exome sequencing reveals a high genetic heterogeneity on familial Hirschsprung disease. Sci Rep. 2015 Nov 12;5:16473. doi: 10.1038/srep16473.

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