Un gusano sin ojos abre una nueva vía para entender y curar una ceguera hereditaria

Laura Fontrodona 1,2

Instituto de Investigación Biomédica de Bellvitge (IDIBELL), L’Hospitalet de Llobregat, 08908 Barcelona.

Vall d’Hebron Instituto de Investigación (VHIR), 08035 Barcelona.

 

En toda célula eucariota, las moléculas de ARN mensajero (ARNm) sufren un proceso de maduración mediante el cual se eliminan sus intrones y se empalman sus exones. Este proceso de “corte y empalme” se denomina splicing y la maquinaria que lo lleva a cabo, el spliceosome, es una de las más complejas y mejor conservadas desde levaduras a humanos. La consecuencia de que el splicing funcione incorrectamente es la producción de proteínas defectuosas en sus funciones.

La Retinosis Pigmentaria (RP) es una enfermedad genética rara en la que la retina degenera causando una pérdida gradual de la visión hasta la ceguera completa. Existen 24 genes implicados en la forma autosómica dominante (adRP), 7 de los cuales codifican para proteínas implicadas en el splicing. Estas proteínas se encuentran en todas las células de nuestro cuerpo, sin embargo cuando se encuentran mutadas en RP el único tejido que desarrolla una patología es la retina.

¿Por qué estas mutaciones sólo afectan a la retina?

La retina es el tejido humano con la tasa de transcripción más elevada, y por eso un proceso de splicing ineficiente podría afectarla especialmente ya que provocaría una reducción de la síntesis correcta de proteínas. Aunque se han realizado muchos estudios en esta dirección, a día de hoy esta hipótesis no se ha podido demostrar con solidez (Tanackovic, 2011)

Los genes de splicing relacionados con la forma autosómica dominante de la retinosis pigmentaria (s-adRP) son esenciales, y por esta razón la mayor parte de la información de la que disponemos proviene de ensayos bioquímicos y estudios in vitro. Para atajar este obstáculo, en el estudio realizado en el laboratorio del Dr. Julián Cerón en el IDIBELL (Institut d’Investigació Biomèdica de Bellvitge) y publicado recientemente en RNA (Rubio-Peña, 2015), hemos utilizado el ARN de interferencia (ARNi) en el gusano Caenorhabditis elegans (C. elegans). Una de las ventajas que ofrece este modelo animal es la posibilidad de silenciar parcialmente la expresión de un gen en todas sus células. Debido a que estos gusanos se alimentan de bacterias, podemos bloquear parcialmente la expresión del gen de interés alimentándolos con bacterias que sobreexpresen el ARNi de ese gen (Fire, 1998). De esta manera, hemos podido estudiar por primera vez en un organismo multicelular completo qué sucede cuando estos genes de splicing no producen las cantidades normales de proteína.

Un gusano deficiente para el gen s-adRP prp-8 que expresa ectópicamente el efector de apoptosis egl-1 (verde) en células de la hipodermis. Imagen cortesía de Laura Fontrodona.

Un gusano deficiente para el gen s-adRP prp-8 que expresa ectópicamente el efector de apoptosis egl-1 (verde) en células de la hipodermis. Imagen cortesía de Laura Fontrodona.

Para investigar el efecto de la inactivación parcial de estos genes que codifican factores de splicing, secuenciamos los ARNm de poblaciones de gusanos con niveles de expresión reducidos de prp-6, prp-8 y prp-31, que son tres de los genes ortólogos de los genes humanos de adRP. Los resultados de esta secuenciación revelaron que existían algunos eventos de retención de intrones en estos animales, pero la frecuencia con la que esto sucedía era solo ligeramente superior a la observada en la población control.

Dos genes que podrían explicar un nuevo mecanismo causante de adRP

El análisis de los perfiles de expresión de poblaciones deficientes para los genes s-adRP también nos proporcionó una lista de genes sobreexpresados. De esta lista, dos de ellos llamaron nuestra atención. El primero fue egl-1, un efector de la vía de apoptosis con un dominio BH3 conservado. Teniendo en cuenta que los transcriptomas nos mostraban el perfil de expresión en el organismo completo, nos cuestionamos si la sobreexpresión de egl-1 se trataba de un fenómeno general o podía ser específico de un tipo celular o tejido. Para salir de dudas, usamos animales transgénicos que expresaban la proteína verde fluorescente (GFP) bajo el control del promotor de egl-1.

Los animales con niveles de expresión reducidos de prp-8 expresaron egl-1 de manera ectópica en la hipodermis. Además, usando cepas de gusanos donde el ARNi sólo tiene efecto en un tejido específicamente, observamos que el ARNi de prp-8 detenía el crecimiento del gusano solo cuando actuaba en la hipodermis pero no cuando lo hacía en las células musculares. En un símil con las células de la retina, las células de la hipodermis también requieren una alta actividad transcripcional ya que sintetizan las proteínas para formar la cutícula del gusano, que este muda cuatro veces durante su ciclo de vida de 3-5 días.

El segundo gen sobreexpresado en el que nos centramos fue atl-1. Este es homólogo del gen humano ATR, uno de los sensores primarios de daño en el ADN. Tanto en humanos como en el gusano, atl-1/ATR responde a lesiones en el ADN producidas por radiación ultravioleta (UV) y por estrés replicativo. Cuando se da una condición de daño o estrés en el ADN, los sensores primarios se activan y atl-1/ATR es reclutado por la proteína RPA (replication protein A) hacia regiones del ADN que hayan sufrido roturas de simple cadena. En este punto nos preguntamos si pequeños defectos en el spliceosome serían capaces de originar daño en el ADN. Para hallar la respuesta usamos un gusano transgénico que expresaba la proteína RPA-1 marcada con GFP. Tras la exposición a rayos UV, los animales deficientes para prp-8 resultaron ser más sensibles a este tipo de agresión ya que acumularon más lesiones en su ADN que los animales control. Por otro lado, la inducción de estrés replicativo mediante el tratamiento con hidroxiurea causó en los animales un efecto similar al producido por el ARNi de prp-8, en el que su desarrollo se estanca antes de llegar a la edad adulta.

En resumen, para entender por qué mutaciones en genes s-adRP causan una patología sólo en la retina proponemos un nuevo mecanismo molecular que no tiene porqué ser excluyente con la propia ineficiencia del proceso de splicing. La hipótesis que ha abierto este estudio demuestra que la reducción de la actividad de genes s-adRP provoca una inestabilidad genómica que, en células con elevadas tasas de transcripción, puede contribuir a activar la vía de muerte celular programada.

En esta investigación presentamos el nemátodo C. elegans como un modelo robusto para profundizar en los mecanismos subyacentes a la adRP. Además, las nuevas tecnologías que permiten la edición del genoma “a la carta” junto con la conservación funcional de los genes de splicing posibilitan la introducción de mutaciones de los genes s-adRP humanos en el gusano (Waaijers and Boxem, 2014), lo que constituiría una excelente plataforma de medicina personalizada donde desarrollar cribados masivos para el descubrimiento de nuevos fármacos en cortos periodos de tiempo.

Artículo original:

Rubio-Peña K, et a. Modeling of autosomal-dominant retinitis pigmentosa in Caenorhabditis elegans uncovers a nexus between global impaired functioning of certain splicing factors and cell type-specific apoptosis. RNA. 2015 Dec;21(12):2119-31. doi: http://dx.doi.org/10.1261/rna.053397.115

Referencias:

Fire A, et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 1998 Feb 19;391(6669):806-11.

Tanackovic G, et al. PRPF mutations are associated with generalized defects in spliceosome formation and pre-mRNA splicing in patients with retinitis pigmentosa. Hum Mol Genet.2011 Jun 1;20(11):2116-30. doi: 10.1093/hmg/ddr094

Waaijers S, Boxem M. Engineering the Caenorhabditis elegans genome with CRISPR/Cas9. Methods. 2014 Aug 1;68(3):381-8. doi: 10.1016/j.ymeth.2014.03.024

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