Diagnóstico molecular por secuenciación masiva de glucogenosis y enfermedades con síntomas clínicos solapantes

Ana I Vega 1,2,3, Celia Medrano 1,2,3, Rosa Navarrete 1,2,3, Lourdes R Desviat 1,2,3, Begoña Merinero 1,2,3, Pilar Rodríguez-Pombo 1,2,3, Isidro Vitoria 4, Magdalena Ugarte 1,2,3, Celia Pérez-Cerdá 1,2,3, Belén Pérez 1,2,3

1Centro de Diagnóstico de Enfermedades Moleculares, Centro de Biología Molecular-SO UAM-CSIC, Universidad Autónoma de Madrid, Campus de Cantoblanco, Madrid

2Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Raras (CIBERER), Madrid

3Instituto de Investigación La Paz (IdiPAZ), Madrid

4Unidad de Nutrición y Metabolopatías, Hospital La Fe, Valencia

Los dos primeros autores y los dos últimos contribuyen  igualmente en este trabajo: Ana I. Vega, Celia Medrano, Celia Pérez-Cerdá y Belén Pérez

 

El término glucogenosis (GSD) comprende un  grupo de enfermedades genéticas caracterizadas por presentar alteraciones en el metabolismo del glucógeno. Hasta el momento, han sido identificados 23 tipos de defectos con un amplio espectro clínico que abarca desde alteraciones hepáticas, cardiacas, musculares y frecuentemente con afectación del sistema nervioso central. Se estima que su incidencia en la población oscila  en 1 caso por cada 2.000 a  43.000 individuos (Ozen et al., 2007; Hicks et al., 2011)

Curiosamente, la variación fenotípica es amplia, y la enfermedad puede tomar diferentes cursos clínicos incluso a pesar de que esté involucrada la misma enzima. También se observa variación en la edad de aparición de los síntomas, morbilidad y mortalidad, y dependiendo del gen afectado y de la mutación específica involucrada el pronóstico puede ser favorable o desfavorable (Pascal Laforet, 2012). En cualquier caso, es imprescindible un diagnóstico precoz si se quiere mejorar la calidad de vida del paciente e instaurar, si fuera posible, un tratamiento adecuado en la mayor brevedad posible. Hasta ahora,  debido a la inespecificidad de su presentación clínica y a la inexistencia de marcadores específicos, el diagnóstico básicamente estaba basado en la secuenciación gen a gen mediante el método tradicional de Sanger, resultando ser un procedimiento muy largo y costoso.  Afortunadamente, el reciente desarrollo de la captura y secuenciación de alto rendimiento ha hecho a la secuenciación masiva una técnica factible para el diagnóstico genético de rutina (Ng et al., 2010), siendo una técnica muy efectiva económicamente y especialmente apropiada en la búsqueda de mutaciones en defectos con alta heterogeneidad genética como son la GSD, defectos congénitos de glicosilación, defectos lisosomales, defectos mitocondriales, etc.  (Jones et al., 2011; DaRe et al., 2013; Fernandez-Marmiesse et al., 2014;  Wang et al., 2013). Además, para genes grandes como es el AGL, causante de la GSD tipo III, el análisis genético convencional consiste en la amplificación de 34 exones y los correspondientes controles de contaminación, además de la consecuente secuenciación bidireccional. La secuenciación masiva no solo permite secuenciar todos los exones de una sola vez, reduciendo el coste y tiempo empleado, sino que facilita el análisis de varios pacientes en el mismo ensayo tras añadir marcadores específicos de secuencia (como un código de barras de DNA) para cada muestra. Además, la secuenciación masiva evita el allele drop out, y en muchos casos permite detectar reordenamientos genómicos, los cuales pueden ser completamente caracterizados utilizando arrays del genoma completo. Todo ello, hace que resulte una técnica de alto rendimiento con menor coste y tiempo de ejecución.

Los investigadores sugieren que en el futuro los análisis bioinformáticos con datos genómicos globales deberían ajustarse según la pureza tumoral. Imagen: Jonathan Bailey (National Human Genome Research Institute, http://www.genome.gov).

La utilización de un panel de exoma clínico junto con una historia detallada del paciente resulta eficaz en el diagnóstico de defectos con fenotipos clínicos solapantes.

Presentamos el uso, tanto de un panel diseñado que captura 120 genes responsables de distintas enfermedades metabólicas, incluidos los genes causantes de GSD, como el panel de exoma clínico Trusight One de Illumina, que captura 4813 genes (12 Mb del genoma humano) asociados a fenotipo clínico descritos en HGMD®, OMIM, GenesTesT.org, con una cobertura mínima de 20x en el 95% de la región exómica. Las librerías de DNA generadas con ambos paneles fueron secuenciadas mediante las plataformas MiSeq o NextSeq500 de Illumina y los archivos de secuencia generados fueron analizados por la plataforma DNAnexus y por el software VariantStudio (Illumina). Una vez descartadas las variantes de secuencia descritas en las bases de datos y aquellas con frecuencias poblacionales altas (MAF mayor del 1%), el resto de variantes fueron priorizadas en función del tipo de mutación, gen afectado y características clínicas y bioquímicas del paciente.

Hemos diagnosticado 23 pacientes GSD, detectando un total de 22 mutaciones (la mayoría de pérdida de función) donde están incluidas 11 mutaciones nuevas.  Más de tres cuartas partes de nuestros pacientes presentaron cambios patogénicos en el gen AGL (OMIM 610860) o en el gen PHKA2 (OMIM 300798), causantes de GSD  tipo III y IX respectivamente, (39% en AGL y 39% en PHKA2), lo que contrasta con otros estudios realizados (Ozen et al., 2007) donde la forma más frecuente de GSD es el tipo IX (gen PHKA2). Incluso, contrasta con los resultados obtenidos por la Asociación Española de GSD (AAEEG, www.glucogenosis.org/), para quienes las formas más frecuente son el tipo V (gen PYGM, OMIM 608455) y tipo II (gen GAA, OMIM 606800).

Aunque en algunos casos de GSD la sospecha clínica es clara para la secuenciación de un gen concreto y parecería innecesaria la secuenciación masiva de todos los genes causantes de esta patología, se han descrito casos de pacientes, secuenciados por Sanger, con sospecha de GSD tipo IV o tipo Ia que posteriormente han sido identificados como GSD tipo III. Este error en la  sospecha de tipo de enfermedad probablemente surge porque los pacientes aún no habían desarrollado el amplio espectro de síntomas en el momento de la evaluación clínica, o presentaban síntomas clínicos atípicos (Wang et al., 2013; Frebourg et al., 2014; Roscher et al., 2014). En base a  los resultados de nuestro estudio junto con otros realizados con anterioridad la secuenciación masiva debería ser usada para confirmar el diagnóstico de GSD aunque el  fenotipo sea aparentemente claro.

Además, mediante el panel Trusight One nos encontramos hallazgos inesperados en 5 pacientes con sospecha de GSD. En dos pacientes con afectación hepática, uno portaba en homocigosis la mutación más frecuente en el gen ALDOB (OMIM 612724, Intolerancia a la Fructosa) y el otro era compuesto heterocigoto para dos mutaciones previamente descritas en el gen LIPA (OMIM 613497, Deficiencia en Lipasa Acida Lisosomal). En los otros 3 pacientes, que presentaban afectación cardiaca o muscular, identificamos cambios descritos en los genes NKX2-5 (OMIM 600584, Tetralogía de Fallot), CPT2 (OMIM 600650, miopatía por deficiencia en carnitina palmitoil transferasa II) y ANO5 (OMIM 608662, Distrofia muscular de cintura y extremidades tipo 2L). En todos los casos, la presentación atípica de la clínica del paciente y el solapamiento de rasgos fenotipos y bioquímicos con las GSD dieron como resultado una sospecha diagnóstica inicial errónea. Por ejemplo, el defecto en LIPA fue descartado por los clínicos por la ligera dislipidemia que presentaba el paciente y el defecto en CPT2 fue descartado por la ausencia de acilcarnitinas en plasma, ambos marcadores bioquímicos de dichas patologías. La re-evaluación de los datos clínicos en estrecha colaboración con los médicos permitió que se realizara un diagnóstico preciso. En consecuencia es de destacar que sin información fenotípica del paciente el análisis genómico tiene un valor médico limitado

Imagen: National Institute of Health, EEUU, http://www.genome.org

El diagnóstico genético es imprescindible para poder llevar a cabo un tratamiento adecuado. Imagen: National Institute of Health, EEUU, http://www.genome.org.

El diagnóstico genético además de proporcionar la posibilidad de asesoramiento genético es imprescindible para instaurar un adecuado tratamiento y evitar daños irreversibles al paciente, aunque esta tarea puede ser de alta complejidad cuando se trata de patologías heterogéneas donde pueden estar implicados múltiples genes. Algunos de los diagnósticos realizados en este trabajo permitieron la prescripción de tratamientos adecuados a los pacientes. Por ejemplo, el paciente con deficiencia en LIPA antes diagnosticado como GSD ahora se ha incluido en un ensayo clínico de reemplazamiento de la proteína (www.synageva.com/) y el paciente con deficiencia en ALDOB  antes diagnosticado de GSD ahora se le ha prescrito una dieta libre de fructosa y ha mejorado considerablemente.

En resumen, los resultados obtenidos demuestran el alto rendimiento de la secuenciación masiva aplicada en defectos altamente heterogéneos genéticamente como es la GSD, respecto al tiempo de ejecución y al coste económico.  Además, el uso de un panel de exoma clínico junto con una historia detallada del paciente resulta altamente eficaz en el diagnóstico de defectos con fenotipos clínicos solapantes, lo que permite preinscribir un correcto tratamiento y  evita que los pacientes sigan un tratamiento inadecuado durante años y años.

Referencia:

Vega AI, et al. Molecular diagnosis of glycogen storage disease and disorders with overlapping clinical symptoms by massive parallel sequencing. Genet Med. 2016 Feb 25. doi: 10.1038/gim.2015.217.

Bibliografía:

DaRe JT, et al. Targeted exome sequencing for mitochondrial disorders reveals high genetic heterogeneity. BMC Med Genet. 2013;14:118. Doi: 10.1186/1471-2350-14-118

Fernandez-Marmiesse A, et al. Assessment of a targeted resequencing assay as a support tool in the diagnosis of lysosomal storage disorders. Orphanet J Rare Dis. 2014;9:59. Doi: 10.1186/1750-1172-9-59

Frebourg T. The challenge for the next generation of medical geneticists. Hum Mutat. Aug 2014;35(8):909-911. Doi: 10.1002/humu.22592

Hicks J, et al. Glycogen storage diseases: a brief review and update on clinical features, genetic abnormalities, pathologic features, and treatment. Ultrastruct Pathol. Oct 2011;35(5):183-196. Doi: 10.3109/01913123.2011.601404

Jones MA, et al. Targeted polymerase chain reaction-based enrichment and next generation sequencing for diagnostic testing of congenital disorders of glycosylation. Genet Med. Nov 2011;13(11):921-932. Doi: 10.1097/GIM.0b013e318226fbf2.

Ng SB, et al. Exome sequencing identifies the cause of a mendelian disorder. Nat Genet. Jan 2010;42(1):30-35. Doi: 10.1038/ng.499

Ozen H. Glycogen storage diseases: new perspectives. World J Gastroenterol. May 14 2007;13(18):2541-2553. Doi: 10.3748/wjg.v13.i18.2541

Pascal Laforet. The Glycogen Storage Diseases  and related Disorders. In: Saudubray JM, Berghe, Walter J.H, ed. Inborn metabolic diseases. 5th ed. Berlin Heidelberg. 2012:115-139.

Roscher A, et al. The natural history of glycogen storage disease types VI and IX: Long-term outcome from the largest metabolic center in Canada. Mol Genet Metab. Nov 2014;113(3):171-176. Doi: 10.1016/j.ymgme.2014.09.005

Wang J, et al. Clinical application of massively parallel sequencing in the molecular diagnosis of glycogen storage diseases of genetically heterogeneous origin. Genet Med. Feb 2013;15(2):106-114. Doi: 10.1038/gim.2012.104

Si te ha gustado el artículo, suscríbete ahora de forma gratuita a la Revista Genética Médica y recíbela cada 2 semanas.


Acepto el Aviso Legal

You may also like...

Deja un comentario