Se identifica un nuevo mecanismo de resistencia a la quimioterapia gracias a la tecnología CRISPR/Cas9

Cristina Mayor-Ruiz1  Sergio Ruiz1 y Óscar Fernández-Capetillo1,2

1Grupo de Inestabilidad Genómica, Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), Madrid, España

2Science for Life Laboratory, Karolinska Institute, Stockholm, Sweden

 

Entre las estrategias quimioterapéuticas basadas en la destrucción selectiva del ADN de las células cancerosas, el concepto de “estrés replicativo” ha despertado un creciente interés en los últimos años. El estrés replicativo es una fuente de daño genómico que puede surgir cada vez que una célula replica su ADN. A nivel molecular, se trata de una acumulación de ADN de cadena sencilla en horquillas de replicación que están paradas. Si dicha acumulación es grande, puede promover la rotura de dichas horquillas y subsiguientes eventos de recombinación.

La presencia de estrés replicativo es una característica frecuente en las células cancerosas, promovida por los oncogenes subyacentes y responsable de gran parte de su inestabilidad genómica (Halazonetis et al., 2008 , Lecona and Fernández-Capetillo, 2014).  En mamíferos, el estrés replicativo es detectado y suprimido por una cascada de señalización iniciada por la quinasa ATR (Cimprich and Cortez, 2008). En nuestro laboratorio, previamente razonamos que la inhibición de ATR debería ser particularmente nociva para células cancerosas con altos niveles de estrés replicativo. Apoyando esta hipótesis, los inhibidores de ATR (iATR) son preferencialmente tóxicos para células que expresan ciertos oncogenes, como MYC o CYCE (Toledo et al., 2011). Por otro lado, modelos de ratón con bajos niveles de ATR son refractarios a la aparición de tumores (Murga et al., 2011).

Con iATR desarrollados por diversas farmacéuticas ya camino de la clínica, decidimos explorar si la resistencia a estos inhibidores era posible, para intentar anticiparnos a este fenómeno tan común en la práctica hospitalaria y que supone una de las principales causas de fracaso de los tratamientos quimioterapéuticos.

Para identificar mutaciones que puedan convertir a las células en resistentes a los iATR, utilizamos la novedosa tecnología de alteración del genoma CRISPR. En primer lugar, generamos una línea de células madre de ratón con expresión regulada por doxiciclina de la nucleasa Cas9, uno de los dos componentes básicos de la tecnología CRISPR. Después, infectamos esta línea celular con una librería de lentivirus que contenía 87897 sgRNAs diferentes, capaces de dirigir la nucleasa Cas9 a la práctica totalidad de los genes del genoma de ratón (Koike-Yusa et al., 2014). Utilizando unas condiciones que permitieran tener un único sgRNA por célula, generamos una colección en la que cada célula tenía mutado un gen diferente.

Tras tratar la colección de células mutantes con iATR previamente desarrollados en el laboratorio (Toledo et al., 2011), pudimos aislar algunas células resistentes y posteriormente identificar la mutación que portaban. De hecho, demostramos que la práctica totalidad de las células capaces de resistir dosis letales de los iATR tenía mutaciones en el gen Cdc25A.  Para confirmar nuestros hallazgos en células humanas, comprobamos que líneas tumorales humanas heterocigotas para dicho gen o en las que disminuimos la expresión de CDC25A mediante siRNAs, también eran resistentes a iATR.

Del mismo modo que la deficiencia en CDC25A hace a las células resistentes al tratamiento, también observamos que la sobreexpresión de CDC25A aumenta la sensibilidad a los iATR. Además, un dato muy importante y complementario a nuestros descubrimientos, es que la expresión de CDC25A es más alta en tumores que ya se conocen como particularmente dependientes de la cascada de respuesta iniciada por ATR, tales como linfomas de Burkitt, leucemia mieloide aguda o linfoma difuso de células B grandes. En conjunto, estos resultados revelan que los niveles de CDC25A determinan la sensibilidad a los iATR, hallazgo que facilita el uso racional de los mismos en la clínica.

Nuestro siguiente objetivo fue entender el mecanismo por el que la pérdida de CDC25A causa resistencia a los iATR, siendo conscientes de que un mayor conocimiento de dicho fenómeno podría facilitar la lucha contra la potencial resistencia en la clínica.

En primer lugar, comprobamos que la inhibición de ATR, como era esperado, inducía ADN de cadena sencilla. Esta inducción era similar en células con y sin CDC25A. Sorprendentemente, al analizar la cantidad de roturas del ADN de doble cadena provocadas típicamente por los iATR, comprobamos que era inexistente en las células CDC25A-deficientes. Por tanto, a pesar de que los iATR generaban estrés replicativo en células con y sin CDC25A, dicho estrés sólo derivaba en efecto citotóxico (roturas del ADN de doble cadena) en presencia de la proteína CDC25A.

En segundo lugar, prestamos atención al conocido rol de la fosfatasa CDC25A en la inducción de la entrada en mitosis. Comprobamos que la inhibición de ATR produce un aumento de los niveles de CDC25A, lo que fuerza a su vez una entrada prematura en mitosis, fase en la que el estrés replicativo se traduce en roturas en el ADN con efecto citotóxico. Esta entrada prematura no puede ocurrir en células sin CDC25A, lo que explica su resistencia a los iATR.

Los resultados presentados ilustran por tanto que la toxicidad de los iATR se debe a una combinación de dos actividades: (A) inducir estrés replicativo (acumulación de ADN de cadena sencilla) y (B) forzar la entrada prematura en mitosis de esas células. Esta segunda característica no es común a otros fármacos inductores de estrés replicativo, característica ventajosa para los iATR en determinados contextos.

Células sin la proteína CDC25A son resistentes a inhibidores de ATR desarrollados en el CNIO (en verde, las roturas en el ADN generadas por el tratamiento; en rojo, células en fase M del ciclo celular). Imagen cortesía de Cristina Mayor (CNIO).

Células sin la proteína CDC25A son resistentes a inhibidores de ATR desarrollados en el CNIO (en verde, las roturas en el ADN generadas por el tratamiento; en rojo, células en fase M del ciclo celular). Imagen cortesía de Cristina Mayor (CNIO).

Por último, estos hallazgos nos llevaron a intentar superar la resistencia a los iATR en las células deficientes en CDC25A, promoviendo la entrada prematura en mitosis con algún otro compuesto. Para ello, utilizamos inhibidores de WEE1, quinasa cuya función principal es la de limitar la entrada en fase M. De acuerdo con nuestra hipótesis, si bien las células carentes de CDC25A son resistentes a los iATR, un tratamiento combinado con inhibidores de WEE1 supera esta resistencia.

A modo de resumen, la importancia de este trabajo reside en la clarificación del mecanismo de acción de los inhibidores de ATR y la identificación de CDC25A como un biomarcador que puede predecir la sensibilidad de los tumores a estos compuestos, y así optimizar su uso racional en la clínica. Asimismo, describe el primer mecanismo conocido de resistencia a los inhibidores de ATR y evidencia el potencial de la combinación de los inhibidores de ATR y WEE1 para superar dicha resistencia. Por último, cabe resaltar la fortaleza de la tecnología CRISPR/Cas9 combinada con células madre de ratón para llevar a cabo rastreos genéticos masivos similares al aquí reportado, que puedan arrojar luz sobre los mecanismos de emergencia de resistencia a otros compuestos usados como quimioterapia, fenómeno que supone una de las mayores causas del fracaso en los tratamientos oncológicos.

Referencia:

Ruiz S, Mayor-Ruiz C, et al. A Genome-wide CRISPR Screen Identifies CDC25A as a Determinant of Sensitivity to ATR Inhibitors. Mol Cell. 2016 Apr 5. doi: 10.1016/j.molcel.2016.03.006.

Bibliografía:

Cimprich, KA, and Cortez, D. ATR: an essential regulator of genome integrity. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. (2008) 9, 616–627.

Halazonetis, TD, et al. An oncogene- induced DNA damage model for cancer development. Science (2008) 319, 1352– 1355.

Koike-Yusa, H, et al. Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library. Nat. Biotechnol. (2014) 32, 267–273.

Lecona, E, and Fernandez-Capetillo, O. Replication stress and cancer: it takes two to tango. Exp. Cell Res. (2014). 329, 26–34.

Murga, M., et al. Exploiting oncogene-induced replicative stress for the selective killing of Myc-driven tumors. Nat. Struct. Mol. Biol. (2011). 18, 1331–1335.

Toledo, LI, et al. A cell-based screen identifies ATR inhibitors with synthetic lethal properties for cancer-associated mutations. Nat. Struct. Mol. Biol. (2011). 18, 721–727.

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