Se identifica un nuevo mecanismo de resistencia a la quimioterapia gracias a la tecnología CRISPR/Cas9

Cristina Mayor-Ruiz1  Sergio Ruiz1 y Óscar Fernández-Capetillo1,2

1Grupo de Inestabilidad Genómica, Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), Madrid, España

2Science for Life Laboratory, Karolinska Institute, Stockholm, Sweden

 

Entre las estrategias quimioterapéuticas basadas en la destrucción selectiva del ADN de las células cancerosas, el concepto de “estrés replicativo” ha despertado un creciente interés en los últimos años. El estrés replicativo es una fuente de daño genómico que puede surgir cada vez que una célula replica su ADN. A nivel molecular, se trata de una acumulación de ADN de cadena sencilla en horquillas de replicación que están paradas. Si dicha acumulación es grande, puede promover la rotura de dichas horquillas y subsiguientes eventos de recombinación.

La presencia de estrés replicativo es una característica frecuente en las células cancerosas, promovida por los oncogenes subyacentes y responsable de gran parte de su inestabilidad genómica (Halazonetis et al., 2008 , Lecona and Fernández-Capetillo, 2014).  En mamíferos, el estrés replicativo es detectado y suprimido por una cascada de señalización iniciada por la quinasa ATR (Cimprich and Cortez, 2008). En nuestro laboratorio, previamente razonamos que la inhibición de ATR debería ser particularmente nociva para células cancerosas con altos niveles de estrés replicativo. Apoyando esta hipótesis, los inhibidores de ATR (iATR) son preferencialmente tóxicos para células que expresan ciertos oncogenes, como MYC o CYCE (Toledo et al., 2011). Por otro lado, modelos de ratón con bajos niveles de ATR son refractarios a la aparición de tumores (Murga et al., 2011).

Con iATR desarrollados por diversas farmacéuticas ya camino de la clínica, decidimos explorar si la resistencia a estos inhibidores era posible, para intentar anticiparnos a este fenómeno tan común en la práctica hospitalaria y que supone una de las principales causas de fracaso de los tratamientos quimioterapéuticos.

Para identificar mutaciones que puedan convertir a las células en resistentes a los iATR, utilizamos la novedosa tecnología de alteración del genoma CRISPR. En primer lugar, generamos una línea de células madre de ratón con expresión regulada por doxiciclina de la nucleasa Cas9, uno de los dos componentes básicos de la tecnología CRISPR. Después, infectamos esta línea celular con una librería de lentivirus que contenía 87897 sgRNAs diferentes, capaces de dirigir la nucleasa Cas9 a la práctica totalidad de los genes del genoma de ratón (Koike-Yusa et al., 2014). Utilizando unas condiciones que permitieran tener un único sgRNA por célula, generamos una colección en la que cada célula tenía mutado un gen diferente.

Tras tratar la colección de células mutantes con iATR previamente desarrollados en el laboratorio (Toledo et al., 2011), pudimos aislar algunas células resistentes y posteriormente identificar la mutación que portaban. De hecho, demostramos que la práctica totalidad de las células capaces de resistir dosis letales de los iATR tenía mutaciones en el gen Cdc25A.  Para confirmar nuestros hallazgos en células humanas, comprobamos que líneas tumorales humanas heterocigotas para dicho gen o en las que disminuimos la expresión de CDC25A mediante siRNAs, también eran resistentes a iATR.

Del mismo modo que la deficiencia en CDC25A hace a las células resistentes al tratamiento, también observamos que la sobreexpresión de CDC25A aumenta la sensibilidad a los iATR. Además, un dato muy importante y complementario a nuestros descubrimientos, es que la expresión de CDC25A es más alta en tumores que ya se conocen como particularmente dependientes de la cascada de respuesta iniciada por ATR, tales como linfomas de Burkitt, leucemia mieloide aguda o linfoma difuso de células B grandes. En conjunto, estos resultados revelan que los niveles de CDC25A determinan la sensibilidad a los iATR, hallazgo que facilita el uso racional de los mismos en la clínica.

Nuestro siguiente objetivo fue entender el mecanismo por el que la pérdida de CDC25A causa resistencia a los iATR, siendo conscientes de que un mayor conocimiento de dicho fenómeno podría facilitar la lucha contra la potencial resistencia en la clínica.

En primer lugar, comprobamos que la inhibición de ATR, como era esperado, inducía ADN de cadena sencilla. Esta inducción era similar en células con y sin CDC25A. Sorprendentemente, al analizar la cantidad de roturas del ADN de doble cadena provocadas típicamente por los iATR, comprobamos que era inexistente en las células CDC25A-deficientes. Por tanto, a pesar de que los iATR generaban estrés replicativo en células con y sin CDC25A, dicho estrés sólo derivaba en efecto citotóxico (roturas del ADN de doble cadena) en presencia de la proteína CDC25A.

En segundo lugar, prestamos atención al conocido rol de la fosfatasa CDC25A en la inducción de la entrada en mitosis. Comprobamos que la inhibición de ATR produce un aumento de los niveles de CDC25A, lo que fuerza a su vez una entrada prematura en mitosis, fase en la que el estrés replicativo se traduce en roturas en el ADN con efecto citotóxico. Esta entrada prematura no puede ocurrir en células sin CDC25A, lo que explica su resistencia a los iATR.

Los resultados presentados ilustran por tanto que la toxicidad de los iATR se debe a una combinación de dos actividades: (A) inducir estrés replicativo (acumulación de ADN de cadena sencilla) y (B) forzar la entrada prematura en mitosis de esas células. Esta segunda característica no es común a otros fármacos inductores de estrés replicativo, característica ventajosa para los iATR en determinados contextos.

Células sin la proteína CDC25A son resistentes a inhibidores de ATR desarrollados en el CNIO (en verde, las roturas en el ADN generadas por el tratamiento; en rojo, células en fase M del ciclo celular). Imagen cortesía de Cristina Mayor (CNIO).

Células sin la proteína CDC25A son resistentes a inhibidores de ATR desarrollados en el CNIO (en verde, las roturas en el ADN generadas por el tratamiento; en rojo, células en fase M del ciclo celular). Imagen cortesía de Cristina Mayor (CNIO).

Por último, estos hallazgos nos llevaron a intentar superar la resistencia a los iATR en las células deficientes en CDC25A, promoviendo la entrada prematura en mitosis con algún otro compuesto. Para ello, utilizamos inhibidores de WEE1, quinasa cuya función principal es la de limitar la entrada en fase M. De acuerdo con nuestra hipótesis, si bien las células carentes de CDC25A son resistentes a los iATR, un tratamiento combinado con inhibidores de WEE1 supera esta resistencia.

A modo de resumen, la importancia de este trabajo reside en la clarificación del mecanismo de acción de los inhibidores de ATR y la identificación de CDC25A como un biomarcador que puede predecir la sensibilidad de los tumores a estos compuestos, y así optimizar su uso racional en la clínica. Asimismo, describe el primer mecanismo conocido de resistencia a los inhibidores de ATR y evidencia el potencial de la combinación de los inhibidores de ATR y WEE1 para superar dicha resistencia. Por último, cabe resaltar la fortaleza de la tecnología CRISPR/Cas9 combinada con células madre de ratón para llevar a cabo rastreos genéticos masivos similares al aquí reportado, que puedan arrojar luz sobre los mecanismos de emergencia de resistencia a otros compuestos usados como quimioterapia, fenómeno que supone una de las mayores causas del fracaso en los tratamientos oncológicos.

Referencia:

Ruiz S, Mayor-Ruiz C, et al. A Genome-wide CRISPR Screen Identifies CDC25A as a Determinant of Sensitivity to ATR Inhibitors. Mol Cell. 2016 Apr 5. doi: 10.1016/j.molcel.2016.03.006.

Bibliografía:

Cimprich, KA, and Cortez, D. ATR: an essential regulator of genome integrity. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. (2008) 9, 616–627.

Halazonetis, TD, et al. An oncogene- induced DNA damage model for cancer development. Science (2008) 319, 1352– 1355.

Koike-Yusa, H, et al. Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library. Nat. Biotechnol. (2014) 32, 267–273.

Lecona, E, and Fernandez-Capetillo, O. Replication stress and cancer: it takes two to tango. Exp. Cell Res. (2014). 329, 26–34.

Murga, M., et al. Exploiting oncogene-induced replicative stress for the selective killing of Myc-driven tumors. Nat. Struct. Mol. Biol. (2011). 18, 1331–1335.

Toledo, LI, et al. A cell-based screen identifies ATR inhibitors with synthetic lethal properties for cancer-associated mutations. Nat. Struct. Mol. Biol. (2011). 18, 721–727.

Si te ha gustado el artículo, suscríbete ahora de forma gratuita a la Revista Genética Médica y recíbela cada 2 semanas.


Acepto el Aviso Legal

Deja un comentario

Tu dirección de correo electrónico no será publicada. Los campos obligatorios están marcados con *

Normas de uso

La Revista Genética Médica permite realizar comentarios sobre su contenido para favorecer la participación de los lectores, con el objetivo de ofrecer una plataforma de debate y discusión sobre los temas tratados.

El contenido de Genética Médica es de carácter general y tiene una finalidad informativa. La mención de cualquier método, terapia, tratamiento o servicio no debe ser considerado una garantía para su utilización. Determinar el adecuado tratamiento para un paciente es responsabilidad de los médicos y facultativos. La información proporcionada en Revista Genética Médica ha sido diseñada para apoyar, y en ningún caso reemplazar, la relación que existe entre un paciente y su médico.

Para asegurar que todos los lectores tienen una buena experiencia, la Revista Genética Médica solicita que los comentarios sigan unas normas básicas. Los comentarios son evaluados antes de su publicación y moderados por los miembros de la Oficina Editorial de Revista Genética Médica diariamente. Cualquier comentario que no cumpla los principios indicados no será publicado.

Los comentarios están abiertos al público general por lo que los lectores deben considerar que su contenido no necesariamente ha sido realizado por un profesional médico.

Los usuarios tendrán en cuenta que los comentarios serán públicos y cualquier persona con acceso a internet podrá verlos. Los usuarios pueden publicar información personal propia (teniendo en cuenta que será pública) pero no la de otras personas. Los comentarios no podrán ser modificados.

Los principios seguidos para la publicación de comentarios serán:

  • Todos los comentarios que contribuyan a enriquecer el contenido y calidad de los contenidos de Revista Genética Médica serán bienvenidos. Los usuarios se comprometen a proporcionar información veraz y contrastable. Cada usuario proporcionará referencias y/o enlaces que justifiquen sus afirmaciones sobre medicina y salud, siempre que no se trate de una experiencia personal vivida por él mismo.
  • En caso de mencionar publicaciones científicas o datos específicos, se citarán las fuentes que en el comentario.
  • Sólo se aceptará la presencia de enlaces en los comentarios cuando su contenido cumpla los principios de publicación de comentarios y estén relacionados con el tema.
  • En caso de mencionar publicaciones científicas o datos específicos, se citarán las fuentes que en el comentario.
  • Sólo se aceptará la presencia de enlaces en los comentarios cuando su contenido cumpla los principios de publicación de comentarios y estén relacionados con el tema.
  • No se aceptarán comentarios difamatorios o falsos, insultos, amenazas, o ajenos al tema del que trate el artículo. En la misma línea no se aprobará la publicación de comentarios con contenido xenófobo, racista, sexista, homófobo o discriminatorio hacia cualquier religión o colectivo.
  • Los mensajes escritos al completo en mayúsculas no serán aceptados.
  • Mensajes publicitarios, o de cuestiones no relacionadas con el tema del artículo no serán aprobados para su publicación.

Si te ha gustado el artículo, suscríbete ahora de forma gratuita a la Revista Genética Médica y recíbela cada 2 semanas.

(function() { if (!window.mc4wp) { window.mc4wp = { listeners: [], forms : { on: function (event, callback) { window.mc4wp.listeners.push({ event : event, callback: callback }); } } } } })();


Acepto el Aviso Legal