Mayor especificidad en la edición de genomas con el sistema CRISPR-Cpf1

Fran Garrigues, Genética Médica News

 

Estructura molecular del sistema CRISPR-Cpf1. En blanco se muestra la nucleasa, y en color el crRNA el ADN diana. Imagen obtenida de la Protein Data Base. 5B43. http://www.rcsb.org

Estructura molecular del sistema CRISPR-Cpf1. En blanco se muestra la nucleasa, y en color el crRNA el ADN diana. Imagen obtenida de la Protein Data Base. 5B43. http://www.rcsb.org

Dos estudios dirigidos por el Centro de Edición Genómica del Instituto Básico de Ciencia (IBS) de Corea del Sur demuestran la superioridad del sistema CRISPR-Cpf1 frente al tradicional CRISPR-Cas como una herramienta de edición genómica más exacta y precisa.

El sistema CRISPR-Cpf1 utiliza una familia de endonucleasas (llamadas Cpf1) guiadas por ARN. Éstas se caracterizan por no requerir de un trans-activador de crARN (tracrARN), a diferencia de los sistema CRISPR-Cas que necesitan de dos ARN: crARN y tracrARN, para reconocer la secuencia de ADN a modificar. Además, frente a Cas9, que corta únicamente secuencias ricas en guanosina, la enzima Cpf1 reconoce secuencias de ADN ricas en timidina, lo que aumenta el número de sitios del genoma susceptibles de editarse. Por último, el sistema CRISPR-Cpf1 es capaz de generar extremos cohesivos, útiles en el mecanismo de reparación de doble cadena de ADN por recombinación no homologa (NHEJ).

Los resultados obtenidos revelaron una elevada especificidad para Cpf1, ya que se detectó un menor número de cortes en sitios no deseados, en comparación con los sitios de corte que puede llegar a realizar Cas9 en el genoma humano. Además, se observó que el porcentaje de indels (que representa el efecto de los sitios no deseados) se encontraba por debajo del 0,1%, lo que sugiere que ambas proteínas Cpf1 no presentan prácticamente dicho efecto.

En el segundo trabajo, el equipo de investigadores corroboró la especificidad de Cpf1 aplicando el sistema de edición en embriones de ratón. Con el objetivo de generar mutantes por mutagénesis dirigida, los científicos inocularon RNPs Cpf1 en 50 embriones de ratón mediante la técnica de electroporación. En este caso, los sistemas CRISPR-Cpf1 utilizados tenían como diana el factor de transcripción Foxn1, encargado de regular el crecimiento del pelo y la enzima Tirosinasa, involucrada en la producción de melanina, pigmento natural de la piel.  Tras inducir la mutagénesis con CRISPR, los embriones se trasplantaron en madres sustitutas con el fin de que se desarrollaran y poder observar el posible fenotipo mutante tras su nacimiento.

Los resultados mostraron que aquellos ratones a los que se les había modificado el factor de transcripción Foxn1 carecían de pelo, mientras que los ratones, que habían sufrido modificaciones en la enzima tirosinasa, eran blancos.  A continuación, llevaron a cabo la secuenciación del genoma completo de un ratón mutante para Foxn1 y de uno de sus hermanos sin mutaciones en el gen. Al comparar ambos genomas, el análisis de la secuencia demostró que no había ocurrido ninguna mutación fuera del sitio específico. En otros mutantes tampoco se demostró ninguna mutación fuera de los sitios deseados. Así, se confirmó que Cpf1 no modifica los sitios del genoma no deseados.

“Puesto que los dos estudios han demostrado la especificidad superior de Cpf1, esta nueva nucleasa será utilizada más ampliamente para la edición de genomas, con mayor precisión y sin producir mutaciones no deseadas,” comenta KIM Jin-Soo director del centro IBS y autor de ambos estudios “Las aplicaciones de CRISPR Cpf1 no tienen límite y permanecen abiertas, empezando por tratamientos terapéuticos como fármacos contra el cáncer no tóxicos, y tratamientos de células madre a ganado y productos agrícolas de alto valor añadido,.

Referencias:

Kim D, et al. Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells. Nat Biotechnol. 2016 Jun 6. DOI: 10.1038/nbt.3609.

Kim Y, et al. Generation of knockout mice by Cpf1-mediated gene targeting. Nat Biotechnol. 2016 Jun 6.  DOI: 10.1038/nbt.3614

Fuente: A New Tool in CRISPR Genome Editing, Cpf1, Proved its Marked Specificity and Produced a Targeted Mutant Mouse. http://www.alphagalileo.org/ViewItem.aspx?ItemId=164839&CultureCode=en

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