El control mitótico de la quinasa polo Cdc5 en dos pasos

 

Jose-Antonio Rodriguez-Rodriguez y Ethel Queralt

Grupo de Ciclo Celular, Programa de Epigenética y Biología del Cáncer (PEBC), Instituto de Investigaciones Biomédicas de Bellvitge (IDIBELL), Av. Gran Via de L’Hospitalet 199-203, 08908 L’Hospitalet de Llobregat, Barcelona

 

Células en división. Los cromosomas, en morado, se han duplicado y la separación de los dos juegos hacia las correspondientes células hijas es dirigida por las fibras del citoesqueleto (en verde). Imagen: Nasser Rusan, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health.

Células en división. Los cromosomas, en morado, se han duplicado y la separación de los dos juegos hacia las correspondientes células hijas es dirigida por las fibras del citoesqueleto (en verde). Imagen: Nasser Rusan, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health.

El ciclo celular es una serie de eventos finamente regulados mediante los cuales una célula parental da lugar a dos células hijas genéticamente idénticas.  La mitosis es la etapa del ciclo celular donde se coordina y se lleva a cabo la segregación de los cromosomas. Pequeños fallos de segregación cromosómica puede originar un reparto no equitativo del material genético, originándose células hijas con un número incorrecto de cromosomas, por lo que la mitosis es por necesidad un proceso altamente controlado. La aparición de células con un contenido de cromosomas erróneo es una característica distintiva de enfermedades como el cáncer o relacionadas con el desarrollo, llegando incluso a provocar abortos de forma espontánea.

La progresión en el ciclo celular está regulada por los complejos formados por las quinasas dependientes de ciclina, Cdk asociadas a las ciclinas específicas de cada fase del ciclo celular: Cdk-ciclinas. El complejo formado por Cdk1  y la ciclina B, Clb2 (Cdk‐Clb2) coordina todos los eventos que gobiernan la correcta segregación de los cromosomas entre las dos células hijas durante la anafase (momento de la mitosis donde se produce el reparto físico de los cromosomas). Los complejos Cdk1-Ciclinas fosforilan una gran variedad de sustratos, por lo que al inicio de la mitosis la célula se caracteriza por estar en un estado de alta fosforilación celular. Al iniciarse la anafase se produce una drástica reducción de la actividad del complejo Cdk-Clb2 provocada por las vías de señalización enzimática conocidas en conjunto como Salida de mitosis. En S. cerevisiae (la levadura de gemación) la salida de mitosis está dirigida por la activación de la fosfatasa mitótica Cdc14; la cual se encuentra durante la mayor parte del ciclo celular inactiva debido a la unión con su inhibidor Net1 que se localiza en el nucléolo. Esta unión es estable gracias a la actividad de otra fosfatasa, PP2A-Cdc55, que mantiene a Net1 en un estado de baja fosforilación al principio de la mitosis. Tras activarse durante la anafase, Cdc14 desfosforila  sustratos previamente fosforilados por el complejo Cdk1-­Clb2 y contribuye con ello a la disminución del estado de fosforilación celular y en definitiva a la salida de mitosis.

La activación de Cdc14 se realiza mediante dos vías independientes: FEAR y MEN.  La activación de la ruta FEAR (acrónimo de cdcFourteen Early Anaphase Release) se produce al inicio de la anafase y requiere de alta actividad Cdk1‐Clb2. Esta primera onda de activación de Cdc14 tiene como contrapartida la caída en la actividad de Cdk1‐Clb2. Por ello, para mantener los niveles de actividad de la fosfatasa Cdc14 la célula requiere de la activación de la segunda vía llamada MEN (del inglés Mitotic Exit Network). MEN es una cascada de fosforilación de tipo Ras GTP y está regulada a diferentes niveles por la quinasa Cdc5 o quinasa polo.

El papel de Cdc5 como regulador de la vía MEN ha sido el más estudiado durante las últimas décadas. Sin embargo, estudios recientes obtenidos utilizando mutantes de Cdc5 indican que la quinasa polo también tiene un papel en la activación de Cdc14 a través de la vía FEAR en anafase temprana. No obstante, el mecanismo molecular mediante el cual la quinasa polo Cdc5 regula la activación de la fosfatasa Cdc14 a través de la ruta FEAR se desconoce. Además, el hecho de que las dos quinasa mitóticas Cdk1‐Clb2 y Cdc5 se auto-regulen mutuamente complica los estudios considerablemente.

Imagen: Dani Lurie (CC BY 2.0)

La correcta transmisión de los cromosomas en la división celular es crítica para la función celular. Imagen: Dani Lurie (CC BY 2.0)

En Rodriguez‐Rodriguez JA et al, se analiza esta compleja relación funcional entre Cdk1-Clb2 y Cdc5, con el objetivo de estudiar el papel de la quinasa Cdc5 en la activación de la fosfatasa Cdc14.  Previamente, habíamos visto que la sobreexpresión ectópica de Cdc5 provoca la liberación de Cdc14 en la célula mediante una inducción de la fosforilación de Net1. Los datos obtenidos en fase G1, donde no hay actividad Cdk1‐Clb2, o en fase M mediante el uso de mutantes sin actividad Cdk1-Clb2, muestran que la activación de Cdc14 mediada por Cdc5 es dependiente de la presencia de actividad de Cdk1-Clb2. Sin embargo, esta dependencia no se debe a la necesidad de la fosforilación de Net1 por Cdk1 en los residuos de Net1 conocidos como dependientes de Cdk1, sino en sitios alternativos y específicos de la quinasa polo Cdc5.

El estudio de los sitios de fosforilación de Net1 dependientes de Cdc5 es otro trabajo en curso en el laboratorio. En este trabajo nos centramos en analizar la hipótesis de que la quinasa polo Cdc5 se active por fosforilación directa de Cdk1-Clb2. De hecho, esta observación la pudimos confirmar estudiando la actividad quinasa de Cdc5, y vimos que Cdc5 sólo es activa como quinasa cuando se fosforila previamente por Cdk1-Clb2. Para identificar los sitios dentro de Cdc5 fosforilados por Cdk1-Clb2 purificamos Cdc5 y la sometimos a un análisis de espectrometría de masas tras la purificación de fosfopéptidos. El análisis por espectrometría de masas identificó importantes sitios de fosforilación de Cdc5 dependientes de Cdk1-Clb2: T70, cerca del extremo N‐terminal de Cdc5, y T238 y T242 en el centro activo del dominio quinasa.

Posteriormente, realizamos estudios in vitro e in vivo de la activación de Cdc14 mediante el uso de alelos de Cdc5 con mutaciones puntuales que simulan el estado fosforilado o desfosforilado de estos residuos identificados por masas. Los resultados en los mutantes en los sitios T238 y T242 muestran que la fosforilación en el centro activo de Cdc5 por Cdk1-Clb2 es esencial para activar su función quinasa lo cual es crucial para su actividad tanto como componente de FEAR como de MEN.  Sorprendentemente, la fosforilación de Cdc5 en el residuo T70 tiene implicaciones importantes en anafase tardía afectando a la función de la vía MEN. Todos estos datos en conjunto indican que la activación de Cdc14 depende de la fosforilación secuencial de Cdc5 por Cdk1-Clb2. En primer lugar, Cdk1-Clb2 tiene que fosforilar a la quinasa polo Cdc5 en el centro activo para activarla como quinasa; y posteriormente, durante la anafase tardía se tiene que fosforilar el residuo T70 de Cdc5 para que sea capaz de llevar a cabo sus funciones relacionadas con la vía MEN.

En un alto número de tumores humanos se han detectado niveles altos de quinasa polo. Dado su papel en la regulación de la segregación cromosómica y como promotor de la mitosis se cree que la quinasa polo puede estar implicada en el crecimiento descontrolado de células con aberraciones cromosómicas y potencialmente malignas.  Más análisis como éste, llevados a cabo en organismos más simples y aprehensibles, serán necesarios para dilucidar las complicadas interacciones funcionales que se dan en las células normales y tumorales, pudiendo así sentar las bases para el desarrollo de nuevas terapias mucho más eficaces y específicas contra el desarrollo de tumores malignos.

Referencia:

Rodriguez‐Rodriguez J-­A, Moyano Y, Játiva S, Queralt E. Mitotic Exit Function of Polo­‐like Kinase Cdc5 Is Dependent on Sequential Activation by Cdk1. Cell Rep. 2016:1-­‐13. doi:10.1016/j.celrep.2016.04.079.

Bibliografía:

Azzam R, et al. Phosphorylation by cyclin B-­Cdk underlies  release of mitotic exit activator Cdc14 from the nucleolus. Science. 2004;305(5683):516-519. doi:10.1126/science.1099402.

Mortensen EM, et al. Cdc28‐dependent regulation of the Cdc5/Polo kinase. Curr Biol. 2005;15(22):2033‐2037. doi:10.1016/j.cub.2005.10.046.

Queralt E, et al. Downregulation of PP2A(Cdc55) phosphatase by separase initiates mitotic exit in budding yeast. Cell. 2006;125(4):719-­‐732. doi:10.1016/j.cell.2006.03.038.

Visintin R, Hwang ES, Amon A. Cfi1 prevents premature exit from mitosis by anchoring Cdc14 phosphatase in the nucleolus. Nature. 1999;398(6730):818-823. doi:10.1038/19775.

Weiß L, Efferth T. Polo-like kinase 1 as target for cancer therapy. Exp Hematol Oncol. 2012;1(1):38. doi:  10.1186/2162-3619-1-38.

 

 

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