La desrepresión de la expresión de muscleblind mejora fenotipos característicos de distrofia miotónica en Drosophila

 

Estefania Cerro-Herreros, Juan M. Fernandez-Costa, María Sabater-Arcis, Beatriz Llamusi, Ruben Artero

Grupo de Genómica Traslacional. Departamento de Genética. Universidad de Valencia-INCLIVA. Valencia. España.

Estructura de Investigación Interdisciplinar en Biotecnología y Biomedicina (ERI BIOTECMED), Universidad de Valencia, Valencia, España.

Unidad Mixta CIPF-INCLIVA, Valencia, España.

 

La distrofia miotónica tipo 1 (DM1) es un trastorno neuromuscular incurable que constituye una seria preocupación clínica, pues al hecho de ser la distrofia muscular más común de inicio adulto se une el hecho de que es altamente discapacitante.

A nivel genético está causada por la presencia de expansiones de cientos de repeticiones del motivo CTG*CAG en la región 3′ no traducida (3′ UTR) del gen de la proteína quinasa de la distrofia miotónica (DMPK: dystrophia myotonica-protein kinase), que aunque de forma normal alberga 5-37 copias del motivo de trinucleótidos, una mutación dinámica puede aumentar este número a más de 5000 copias de la repetición. Los transcritos DMPK mutantes (>50 CUGs), se pliegan en horquillas que secuestran factores de corte y empalme (splicing) alternativo, principalmente proteínas de la familia MBNL, que son similares a la proteína Muscleblind (MBNL, abreviatura en inglés de Muscleblind-like) de Drosophila. Además, DMPK mutante activa una proteína quinasa C que fosforila y estabiliza a CELF1, otro factor de splicing y un antagonista de MBNL1. Todo esto da lugar a patrones splicing anormales de multitud de otros transcritos y a la expresión de formas fetales de estos mismos en pacientes. Por todo ello a nivel molecular DM1 se define como una espliceopatía.

Clínicamente, la DM1 se considera un trastorno multisistémico, que afecta principalmente al músculo esquelético, al sistema nervioso y al corazón. La gravedad de la enfermedad se correlaciona con el tamaño de las expansiones y entre los síntomas típicos que encontramos en los pacientes destacan miotonía, debilidad muscular y atrofia, afectación de la musculatura lisa y cardiaca, arritmias cardiacas malignas, disfunciones del sistema nervioso central que incluyen déficit de atención, patrones de personalidad característicos, alteraciones del sueño diurno y síndrome disejecutivo, entre otros, trastornos endocrinos, e incluso fallos respiratorios. Todo ello reduce la esperanza de vida de los pacientes con la forma más común de la enfermedad (la de inicio en la adolescencia o segunda década de vida).

Hasta ahora, las estrategias terapéuticas que se habían testado en diferentes modelos animales iban dirigidas a la degradación de los transcritos DMPK mutantes mediante el desarrollo de espaciómeros (“gapmers”), a evitar el secuestro de Muscleblind a las expansiones por medio de la generación de moléculas pequeñas, péptidos o morfolinos con secuencia complementaria a las expansiones. A pesar del gran esfuerzo en hallar una estrategia eficaz para DM1, ninguno de los abordajes planteados ha llegado a la clínica. Sin embargo, una alternativa poco estudiada en DM1 es la modulación terapéutica de la expresión génica, que persigue aumentar o disminuir la expresión endógena de un gen para aliviar un determinado estado patológico, en nuestro la modulación de la expresión centrada en MBNL. Varias observaciones sugieren que la sobreexpresión de MBNL puede tener potencial para el tratamiento de la patología de la DM1, pues la administración de la proteína Mbnl1 recombinante a un modelo de DM1 de ratón HSALR, rescata la miotonía y las alteraciones del splicing características de la DM1 (Kanadia et al., 2006).

Llegados a este punto y siendo conocedores de que los microRNAs (miRNAs) son pequeñas moléculas ampliamente conocidas por su función como represores de la expresión génica, como investigadores nos preguntamos sí podíamos aumentar la expresión endógena de muscleblind por medio del silenciamiento de miRNA en un modelo de DM1 en Drosophila.

Esta prueba de concepto se llevó a cabo en un modelo de DM1 de Drosophila melanogaster, en el que se sobreexpresan repeticiones no codificantes de trinucleótidos CUG en el músculo, gracias al sistema de expresión UAS/Gal4 y a la presencia de un driver específico de musculatura Myosin heavy chain (Mhc)-Gal4. Estas moscas modelo DM1 se cruzaron con moscas que expresan unas construcciones señuelo o ‘’sponge’’. Es decir, expresan ARN que contienen muchas dianas para un miRNA dado, generando silenciamiento de los mismos.

Imágenes confocales de secciones longitudinales de IFM (músculos indirectos de vuelo. (a) Vemos la distribución Muscleblind (Mbl) en bandas sarcoméricas en las moscas control. (b) Por el contrario en moscas modelo de DM1 Mbl se encuentra en forma de agregados nucleares, como muestra la flecha en la imagen. (c y d) muestran como los dos microRNAs dme-miR-277 o dme-miR-304 tienen un efecto sobre la distribución subcelular de Muscleblind, liberándolo de las expansiones y aumentando sus niveles en núcleo y citoplasma en las moscas modelo DM1.

Imágenes confocales de secciones longitudinales de IFM (músculos indirectos de vuelo. (a) Vemos la distribución Muscleblind (Mbl) en bandas sarcoméricas en las moscas control. (b) Por el contrario en moscas modelo de DM1 Mbl se encuentra en forma de agregados nucleares, como muestra la flecha en la imagen. (c y d) muestran como los dos microRNAs dme-miR-277 o dme-miR-304 tienen un efecto sobre la distribución subcelular de Muscleblind, liberándolo de las expansiones y aumentando sus niveles en núcleo y citoplasma en las moscas modelo DM1.

 

Este modelo se utilizó para explorar el potencial terapéutico del silenciamiento de microRNAs específicos (miRNAs) impulsando con ello la expresión de muscleblind. Los ensayos realizados con dicho modelo, demuestran que es posible la regulación al alza de las proteínas Muscleblind endógenas de Drosophila mediante el secuestro de miRNAs que modulan negativamente su expresión, concretamente mediante el uso de construcciones “esponja o señuelo”.

Para ello, se partió de un conjunto de miRNA identificados como potenciales reguladores de muscleblind, encontrando que sólo el silenciamiento específico de dos de los miRNAs del juego inicial, dme-miR-277 o dme-miR-304, dio lugar al efecto directo deseado: un aumento de los niveles tanto de la proteína Muscleblind como del correspondiente mRNA. Pero este silenciamiento de los dos miRNAs además, tuvo un efecto sobre la distribución subcelular de Muscleblind, liberándolo de las expansiones y aumentando sus niveles en núcleo y citoplasma en las moscas modelo DM1.

Los resultados del estudio mostraron como la des-represión de muscleblind era suficiente para rescatar de forma significativa diferentes eventos de splicing alterados en DM1, esta regulación al alza tuvo como resultado la reversión del splicing aberrante de diferentes transcritos como Serca y Fhos regulados por muscleblind.

Este aumento de muscleblind también tuvo efecto a nivel funcional, puesto que el silenciamiento de dme-miR-277 y de dme-miR-304 era capaz de aumentar el área muscular, indicativo de un rescate del fenotipo atrófico de estas moscas y característico de la enfermedad. Asimismo, las moscas modelo en las que se llevó a cabo el ensayo mostraron una mejora funcional en los ensayos de vuelo y de escalada, mejorando así su actividad locomotora, lo cual se correlacionaba con la mejora en el área muscular. A nivel fisiológico y funcional, uno de los aspectos más interesantes a destacar del estudio fue incremento de la esperanza de vida de la moscas modelo de DM1, ya que la esperanza de vida se encuentra reducida al igual que en pacientes de la enfermedad.

Por tanto, esta prueba de concepto en Drosophila demuestra que el silenciamiento de miRNAs represores específicos favorece un incremento de los niveles de muscleblind, suficiente para rescatar diferentes aspectos moleculares y fisiológicos de la patología. Estos resultados son prometedores puesto que abren la ventana al análisis en modelos humanos y murinos de oligonucleótidos que bloqueen miRNAs, reguladores de Muscleblind, con el fin de aumentar los niveles de expresión de este gen como diana terapéutica para el tratamiento de la DM1.

Referencias:

Cerro-Herreros, E et al Derepressing muscleblind expression by miRNA sponges ameliorates myotonic dystrophy-like phenotypes in Drosophila. Sci Rep. 2016 Nov 2;6:36230. doi: 10.1038/srep36230.

Kanadia RN, et al. Reversal of RNA missplicing and myotonia after muscleblind overexpression in a mouse poly(CUG) model for myotonic dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Aug 1;103(31):11748-53. Doi: http://dx.doi.org/10.1073/pnas.0604970103

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