Detección de ADN con nuevas plataformas basadas en CRISPR

Nuevas plataformas basadas en CRISPR para detectar ADN y diagnosticar enfermedades: DETECTR y SHERLOCK

Amparo Tolosa, Genética Médica News

 

No es una novedad que el sistema CRISPR puede ser utilizado para algo más que editar el genoma. Lo que sí que sigue asombrando es la cantidad de aplicaciones y soluciones tecnológicas que pueden derivar de un mecanismo de defensa bacteriano. La última de ellas es la de la detección de enfermedades.

Hace unos días, los laboratorios de Feng Zhang del Broad Institute del Massachusetts Inistitute of Technology (MIT) y Jennifer Doudna de la Universidad de California en Berkeley  publicaban dos trabajos paralelos en los que describían sus plataformas basadas en CRISPR para detectar ADN en diferentes tipos de muestras. Ambas plataformas pueden ser utilizadas para detectar la presencia de virus o ADN tumoral en muestras biológicas, por lo que tienen un gran potencial en el campo del diagnóstico de enfermedades.

Detectar ADN con una tira de papel

En mayo de 2017, el laboratorio de Feng Zhang publicaba un trabajo en el que describía el funcionamiento de SHERLOCK (Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing), una plataforma para detectar moléculas de ácidos nucleicos. SHERLOCK utiliza la misma filosofía que el tradicional sistema CRISPR formado por una enzima nucleasa que es guiada por una molécula de ARN hacia su secuencia diana en los ácidos nucleicos. En el caso de SHERLOCK, no obstante, los investigadores no utilizaron Cas9, la nucleasa que se utiliza principalmente para editar el genoma, sino que utilizaron Cas13a, que tiene como característica que cuando se activa muestra actividad RNAsa y fragmenta ARN.

El SHERLOCK original funciona de la siguiente forma: en presencia de la molécula de ARN que se pretende detectar, el ARN guía (diseñado para complementar el ARN diana) interacciona con la misma y activa a Cas13a; entonces, la actividad RNAsa de Cas13a hace que la nucleasa fragmente moléculas de ARN  suministradas a la reacción que liberan señales que pueden ser detectadas.

En el nuevo trabajo, el equipo de Zhang ha optimizado SHERLOCK aumentando su sensibilidad y adaptándolo para poder detectar diferentes ácidos nucleicos en una única prueba. Además, ha diseñado una tira de papel que permite llevar a cabo la detección sin necesidad de disponer de equipos especiales. De este modo, la detección positiva de los ácidos nucleicos se muestra de forma similar a los resultados de un test de embarazo: la tira de papel se sumerge en una muestra procesada y una reacción de color indica la presencia o ausencia del ADN a detectar.

 

detección de ADN

Jonathan Gootenberg y Omar Abudayyeh con una tira de papel de la prueba que muestra un resultado positivo de detección de ADN. Imagen: Laboratorio de Feng Zhang, Instituto Broad, MIT.

 

Los investigadores han demostrado el potencial de la nueva versión de SHERLOCK para detectar la presencia de los virus Zika y Dengue de forma simultánea, así como la de ADN tumoral circulante en muestras de sangre de pacientes con cáncer de pulmón.

“SHERLOCK proporciona un método diagnóstico que es fácil de usar,  sensible y no caro para detectar ácidos nucleicos, lo que puede significar un virus, ADN tumoral y muchas otras dianas,” señala Feng Zhang. “Las mejoras en SHERLOCK nos dan ahora incluso más información diagnóstica y nos acerca a una herramienta que puede ser utilizada en aplicaciones reales.”

Reacción “todo en uno” para detectar ADN

La aproximación del equipo de Doudna es similar, con algunas variaciones. En este caso la plataforma desarrollada para detectar el ADN en diferentes muestras biológicas se denomina DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) y utiliza como enzima nucleasa a Cas12a. Al igual que en los otros sistemas, CRISPR Cas12a va acompañada de un ARN guía complementario ADN a detectar que facilita que la proteína localice su diana.

Estructura molecular de la nucleasa Cas12a unida al ADN diana. Imagen: Protein Database 5NFV visualizada con NGL Viewer.

Cas12a tiene la misma característica que Cas13a y cuando se activa corta tanto el ADN diana como cualquier molécula de ADN de cadena simple que esté cerca. Y al igual que en SHERLOCK, los investigadores se aprovechan de esta característica para detectar la activación de la nucleasa. El equipo utilizó moléculas de ADN de cadena sencilla marcadas de tal forma que liberan una señal fluorescente cuando son fragmentadas. Así, cuando Cas12a se activa por el reconocimiento de la secuencia diana por parte del ADN guía y empieza a fragmentar las moléculas de ADN reporteras, se genera una señal fluorescente que es detectada por los investigadores.

“Esta proteína funciona como una herramienta robusta para detectar ADN de una variedad de fuentes,” señala Janice Chen, primera autora del trabajo. “Queremos impulsar los límites de una tecnología que es potencialmente aplicable a cualquier situación diagnóstica en la que hay un componente de ADN, incluyendo el cáncer y las enfermedades infecciosas”.

Para aumentar la sensibilidad de DETECTR, el equipo de Doudna ha incorporado un elemento extra a la reacción, que permite amplificar el ADN diana y facilitar su detección por parte del ARN guía. Una de las ventajas del método es que permite detectar el ADN en una única reacción a la que se incorporan todos los componentes necesarios.

El equipo de Doudna ha demostrado el potencial de DETECTR en la detección de cepas patogénicas del  virus del papiloma humano  en muestras de pacientes con diferentes tipos del virus.

Utilidad de los métodos de detección de ADN basados en CRISPR

El desarrollo de plataformas como SHERLOCK o DETECTR muestra cómo el estudio de los mecanismos de procesos biológicos básicos puede derivar en aplicaciones de gran utilidad tecnológica. Analizar el funcionamiento de enzimas como Cas12a o Cas13a ha derivado en este caso en herramientas que detectan ADN en concentraciones mínimas y pueden  llegar a convertirse en pruebas diagnósticas en la práctica clínica. “Continuamos fascinándonos por las funciones de los sistemas bacterianos CRISPR y cómo entender sus mecanismos lleva a oportunidades de nuevas tecnologías,” señala Doudna.

Las dos plataformas han sido desarrolladas por equipos rivales tanto en el laboratorio como fuera de él. Los laboratorios de Zhang y Doudna son punteros en la investigación CRISPR, así como los primeros en plantear la utilización de CRISPR como sistema para editar el genoma. Además, el Instituto Broad del MIT y la Universidad de Berkeley se encuentran en el centro de una batalla legal por las patentes de CRISPR.  Quedará por ver si SHERLOCK y DETECTR también compiten en su posible implementación en la práctica clínica.

Investigación original:

Chen JS, et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 2018. Doi: http://dx.doi.org/10.1126/science.aar6245

Gootenberg JS, et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 2018. Doi: http://dx.doi.org/10.1126/science.aaq0179

Fuente:

CRISPR scissors, Cas12a, enables cutting-edge diagnostics. http://news.berkeley.edu/2018/02/15/crispr-scissors-cas12a-enables-cutting-edge-diagnostics/

SHERLOCK team advances its CRISPR-based diagnostic tool. https://www.broadinstitute.org/news/sherlock-team-advances-its-crispr-based-diagnostic-tool

 

 

 

 

 

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