Caracterización del interactoma de la Leucemia Mieloide Aguda

 

Ibáñez, M.1,2,3, Carbonell-Caballero, J.4, Sanz, MA. 1,2, Dopazo, J.5,6,7, Cervera, J.1,2,8

1 Servicio de Hematología, Hospital Universitario y Politécnico La Fe, Valencia, Spain.

2 Centro de Investigacion Biomédica en Red de Cáncer (CIBERONC), Instituto Carlos III, Madrid, España.

 3Departamento de Ciencias Biomédicas. Facultad de Ciencias de la Salud. Universidad CEU Cardenal Herrera. Valencia, España.

4 Centre for Genomic Regulation (CRG), Carrer del Dr. Aiguader, 88, 08003 Barcelona, Spain.; 5 INB-ELIXIR-SP, SEVILLA, España.

6 Bioinformatics of Rare Diseases (BIER), CIBER de Enfermedades Raras (CIBERER), Sevilla, España.

7Clinical Bioinformatics Area. Fundación Progreso y Salud (FPS). CDCA, Hospital Virgen del Rocio. 41013. Sevilla. España.

8Genetics Unit, Hospital Universitario y Politécnico La Fe, Valencia, España.

 

 

La leucemia mieloide aguda (LMA) es una enfermedad clonal resultante de la transformación maligna de células madre hematopoyéticas debido a la adquisición secuencial de lesiones en el DNA. Estas alteraciones provocarían una proliferación inadecuada y una capacidad indefinida de auto-renovación, escapando a las señales de diferenciación y muerte celular programada (Mrózek K, 2007). Las alteraciones citogenéticas son frecuentes en la LMA, sin embargo, un 50% de los pacientes presenta un cariotipo aparentemente normal (CN) siendo su pronóstico heterogéneo, sugiriéndose que existan distintos mecanismos moleculares capaces de desarrollar la enfermedad con diferentes implicaciones pronosticas (Mrózek K, 2004). Aunque han sido muchos los esfuerzos por identificar biomarcadores con relevancia en el diagnóstico y/o el pronóstico de los pacientes con LMA, muy pocos de ellos han mostrado una solidez suficiente como para ser incorporados a la práctica clínica.

La aplicación de técnicas de ultrasecuenciación (NGS) en la LMA, ha contribuido a ampliar el listado de genes que parecen estar implicados en la patogenia de estos trastornos, reflejando su complejidad y describiendo patrones de cooperación y exclusión entre diferentes genes y rutas celulares involucradas. En los últimos años, TCGA ha recopilado datos de la secuenciación exómica o genómica, la expresión, la metilación y el genotipo de 200 pacientes adultos con LMA, identificando 23 genes recurrentemente mutados (TCGA, 2013). Asimismo, recientemente, Papaemmanuil et al. (2016) han definido 3 subgrupos moleculares adicionales en pacientes con LMA con implicaciones pronosticas. Sin embargo, pese al papel leucemogénico adjudicado a muchas de las anomalías génicas recientemente descritas, ninguno de los sistemas de clasificación actuales basados en estas alteraciones son del todo exactos. Así pues, en la práctica clínica diaria principalmente nos basamos en la presencia de alteraciones citogenéticas y de 3 marcadores moleculares bien establecidos, NPM1, CEBPA y FLT3-ITD, para la clasificación diagnóstica de los pacientes con LMA (Döhner H, 2015). Por ello, se requiere una comprensión más completa de los cambios genéticos que son relevantes en la patogénesis de la LMA para mejorar la clasificación de los grupos de riesgo y, en última instancia, desarrollar terapias dirigidas. En este sentido, existe un nicho de especial interés, las LMA-CN que carecen de mutaciones cuyo valor pronóstico independiente ha sido bien establecido mostrando un riesgo citogenético intermedio (RI) para la supervivencia y recaída.

Para ampliar nuestro conocimiento sobre las alteraciones genéticas implicadas en LMA-CN, en este estudio hemos llevado a cabo la secuenciación del exoma completo (WES) de muestras pareadas somática/germinal en una cohorte de 7 pacientes con LMA de novo sin mutaciones en NPM1, CEBPA o FLT3-ITD. Las mutaciones detectadas fueron validadas en ambas muestras por secuenciación masiva dirigida usando una plataforma de NGS distinta. Los genes identificados a partir de este análisis se estudiaron en una cohorte de validación independiente de 100 pacientes con LMA-RI de novo mediante secuenciación dirigida. Finalmente, se emplearon modelos funcionales in silico de rutas celulares para establecer aquellas que estuvieran alteradas y fueran fundadoras de la enfermedad en estos pacientes (Ibáñez M, 2016).

Del análisis de los datos obtenidos mediante la WES, identificamos un total de 402.412 variantes. Tras el análisis primario se seleccionaron 102 alteraciones somáticas de alta calidad, lo que representó una media de 30 mutaciones/muestra (rango 22-37). De ellas, se confirmaron 64/102 variantes en 55 genes, estando 26 de ellos previamente reportados en la literatura.

 

interactoma leucemia

Figura 1. Análisis de rutas (SNOW; Babelomics) aplicado a 28 genes seleccionados. Genes relevantes en LMA analizados en base al análisis de pathwaysse coloreados según su grupo categórico: pacientes con CN y/o mutaciones genéticas bien conocidas (Grupo 1, rojo), pacientes con CN y sin mutaciones en NPM1, CEBPA y FLT3-ITD (Grupo 2, verde) y pacientes de riesgo citogenético intermedio (RI) con anormalidades citogenéticas y/o características moleculares conocidas (Grupo 3, azul). Los nodos grises representan la interacción proteína-proteína.

 

Posteriormente, en la cohorte de validación independiente de 100 pacientes con LMA-RI de novo se realizó la secuenciación masiva dirigida de un panel de 87 genes, detectándose 158 variantes [4.89 mutaciones/muestra (rango 0-10)]. Las variantes afectaron a 73 genes distintos, 28 de ellos recurrentemente mutados, siendo los más frecuentes DNMT3A, NPM1, NRAS, KRAS, FLT3, IDH2 e IDH1, tal y como se había descrito previamente. Del mismo modo, mediante el análisis in silico se detectaron principalmente 3 patrones de coocurrencia, confirmándose hallazgos anteriormente publicados.

Cuando nos centramos en los pacientes de la cohorte de validación con CN y sin mutaciones en los genes NPM1, CEBPA ni FLT3-ITD (n= 24/100), encontramos que todos eran portadores de mutaciones somáticas. El 75% de ellos, presentaban variaciones en los genes ASXL1, DNMT3A y/o RUNX1. Otros genes que también se encontraron mutados fueron DNAH9, IDH2, WT1, DNAH8, NRAS o TET2. Además, observamos que las mutaciones en DNMT3A tendían a darse de forma aislada, sin embargo, las alteraciones en ASXL1 y RUNX1 aparecían de forma simultánea en los pacientes. DNMT3A y ASXL1 son ambos reguladores epigenéticos, por ello, su presencia alterada en estos pacientes, podría derivar en una consecuencia común al perturbar la regulación epigenética. Estos análisis se extendieron al analizar las mutaciones detectadas en los pacientes analizados por el TCGA con las mismas características biológicas (n=20/200). En esta cohorte resultante de 44 pacientes, los genes más frecuentemente mutados fueron DNMT3A, RUNX1, ASXL1e IDH2.

Consecutivamente, ejecutamos la priorización de genes candidatos, lo que nos permitió definir un modelo in silico que agrupaba las alteraciones encontradas en base a su interacción física, regulación, funcionalidad y rutas celulares alteradas. El análisis incluyó el interactoma de 28 genes candidatos en base a su frecuencia y a su posible impacto en la proteína, poniendo de manifiesto que 19 estaban más relacionados entre sí de lo esperado por el azar (P = 0,02). Asimismo, 13 de ellos presentaron un porcentaje de mutaciones mayor que los controles sanos de los 1.000 genomas (P≤0,01). Aunque no estaba siempre la misma vía alterada, sí que predominaba una sobre las otras. Observamos que más de la mitad de los pacientes presentaban alteraciones en genes encargados de la metilación del DNA. Además, vimos que es necesaria la combinación de mutaciones que afecten a otras vías celulares tales como las señales de activación o las encargadas de la modificación de la cromatina que, junto a mutaciones en los factores de transcripción o del complejo de la cohesina, puedan desencadenar la leucemogénesis.

Finalmente, clasificamos a los 100 pacientes en 3 grupos distintos en base a sus alteraciones moleculares. Los análisis de redes in silico mostraron 3 vías diferentes bastante similares entre ellas y definimos un único modelo que incluía todas las alteraciones detectadas. Así, se estableció un grupo de genes que podrían estar implicados potencialmente en la leucemogénesis en ausencia de alteraciones citogenéticas, como son NSD1, PLCE1, NFATC2, EPHB1, ERG, y PIK3R1. Las vías afectadas por la presencia de estas mutaciones podrían tener un efecto similar en la célula leucémica que las alteraciones citogenéticas clasificadas dentro del grupo de riesgo citogenético intermedio.

En resumen, este estudio describe un análisis completo de los pacientes con LMA-CN combinando WES, NGS dirigida y un análisis de enriquecimiento de rutas génicas. Como resultado, en 100 pacientes con LMA, hemos descrito mutaciones en 73 genes, siendo 35 mutaciones recurrentes. Además, hemos definido un modelo funcional del interactoma de la LMA identificando un conjunto de genes que pueden desencadenar la leucemogénesis, teniendo especial relevancia aquellos implicados en la regulación epigenética. Estos resultados, si bien requieren de estudios de validación funcional, nos llevan a pensar que el efecto de las mutaciones genéticas sobre rutas biológicas clave, podría ser al menos tan importante como la combinación de mutaciones presentes en cada paciente.

Referencia bibliográfica:

Ibáñez M, Carbonell-Caballero J, Such E, García-Alonso L, Liquori A, López-Pavía M, et al. (2018) The modular network structure of the mutational landscape of Acute Myeloid Leukemia. PLoS ONE 13(10): e0202926. doi:10.1371/journal.pone.0202926

Referencias

Döhner H, et al. Acute Myeloid Leukemia. N Engl J Med. 2015 Sep 17;373(12):1136-52

Ibáñez M, et al. The Mutational Landscape of Acute Promyelocytic Leukemia Reveals an Interacting Network of Co-Occurrences and Recurrent Mutations. PLoS One. 2016

Mrózek K, et al. Clinical relevance of mutations and gene-expression changes in adult acute myeloid leukemia with normal cytogenetics: are we ready for a prognostically prioritized molecular classification? Blood 2007;109:431-48.

Mrózek K, et al. Cytogenetics in acute leukemia. Blood Rev 2004;18:115-36.

Papaemmanuil E, et al. Genomic Classification and Prognosis in Acute Myeloid Leukemia. N Engl J Med. 2016

The Cancer Genome Atlas Research Network. Genomic and epigenomic landscapes of adult de novo acute myeloid leukaemia. N Engl J Med 2013. 368: 2059-74.

 

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